异槲皮素是一种在多种药用植物中广泛存在的类黄酮糖苷，因具有保护心脏、抗糖尿病、抗过敏、抗癌和抗病毒等特性而受到越来越多的关注。异槲皮素可以通过药用植物提取，但提取过程耗时费力、效率低下。随着合成生物技术得发展，在微生物中通过异源表达糖基转移酶进行生物合成成为一种安全且可持续生产异槲皮素的方法。尽管在微生物宿主中进行了许多研究，但目前异槲皮素的生产水平仍然无法满足工业标准。
图1 合成异槲皮素的枯草芽孢杆菌组合代谢工程
强化UDP-葡萄糖的供应以提高异槲皮素产量
作者通过增强前体UDP-葡萄糖的供应来提高异槲皮素的产量。首先，作者使用启动子P43和PsrfA单独/组合过表达编码葡萄糖磷酸变位酶的pgcA基因和编码葡萄糖-1-磷酸尿苷转移酶的gtaB基因，产生菌株BS101G、BS102G和BS103G。尽管BS103G菌株的UDP-葡萄糖含量比对照菌株高出223.6%，但并未对异槲皮素的产量产生显著影响。作者进一步分析发现发酵48 h后有高达90%的槲皮素被消耗，表明槲皮素的降解限制了异槲皮素在枯草芽孢杆菌中的积累。
图2 对枯草芽孢杆菌产生的代谢物进行HPLC和LC-MS分析
鉴定和消除槲皮素的降解途径
作者在BS103G菌株中观察到槲皮素大量降解，导致异槲皮素产量低。因此，作者鉴定并敲除了与槲皮素降解相关的基因，包括环裂解双加氧酶（yxaG，ydfO、mhqA、yodE）和非特异性氧化还原酶（yhjG，yetG，yetO，catE，moxC，ycnE，yoaI）。这些基因的敲除显著降低了槲皮素的降解。在BS221G菌株中，异槲皮素的产量增加到了1.64 g/L。这些结果表明，通过阻断槲皮素的降解，可以克服异槲皮素生物合成中的限速步骤，从而提高产量。
图3 敲除槲皮素降解途径基因对异槲皮素积累的影响
减少异槲皮素的去糖基化并强化槲皮素的糖基化
菌株BS221G中异槲皮素的产量仅为1.64 g/L，异槲皮素与其前体槲皮素的摩尔比约为1:2.7，表明从槲皮素合成异槲皮素是一个关键的限速步骤。为了提高产量，作者研究了异槲皮素去糖基化和槲皮素的糖基化是否限制了合成进程。作者通过敲除枯草芽孢杆菌中的三个β-葡萄糖苷酶基因（bglH、bglA和bglC），异槲皮素的产量得到了显著提升，尤其是在三重敲除菌株BS306G中，产量增加了118.3%。
随后作者进一步通过敲除磷酸葡萄糖异构酶基因（pgi），重新分配了合成UDP-葡萄糖的碳通量，从而强化槲皮素的糖基化。与菌株BS306G相比，菌株BS400G的异槲皮素的产量提高了62.8%。此外，尽管pgi的敲除显著降低了细胞生长，但细胞内UDP-葡萄糖的浓度增加了7.44倍。这些结果进一步证明了UDP-葡萄糖供应不足是异槲皮素生产的限速因素。
作者还考察了在菌株BS400G中添加不同浓度槲皮素对异槲皮素产量的影响，发现随着槲皮素浓度的增加，异槲皮素的产量也相应提高，表明通过优化槲皮素的添加量，可以进一步提升异槲皮素的生产潜力。
图4 减少异槲皮素的去糖基化并增强槲皮素的糖基化以改善异槲皮素的积累
图5 添加槲皮素对菌株BS400G合成异槲皮素的影响
通过补料分批发酵生产异槲皮素
作者在1.3 L发酵罐中进行菌株BS400G发酵生产异槲皮素。在指数生长期，细胞生长迅速，葡萄糖快速消耗，通过调整补料速率保持葡萄糖浓度在20 g/L以下。菌株BS400G的最大OD600值在66 h达到36.4。然而，在24 h添加底物槲皮素后，生物量进入缓慢增长阶段，表明槲皮素对细胞生长有毒性。在84 h时，异槲皮素的最大产量达到25.7 g/L，槲皮素的转化率为83.6%。
pgi的敲除显著降低了细胞生长，作者通过额外添加葡萄糖和果糖以及调整补料速率减轻pgi基因敲除对细胞生长的影响。BS400G菌株的最大OD600值达到43.1，增加了18.4%。异槲皮素的最大产量达到35.6 g/L，槲皮素的转化率为77.2%，生产强度提高到0.59 g/L/h，是分批发酵（0.28 g/L/h）的2.1倍。
图6 在发酵罐中进行补料分批发酵生产异槲皮素
