NC｜原小檗碱型和苯并菲啶型生物碱在酵母中的从头合成

原小檗碱和苯并菲啶类生物碱是苄基异喹啉生物碱（BIA）的分支，具有抗菌、抗病毒、抗高脂血症等多种药理活性。本文作者构建了一系列工程化酵母菌株，实现了从头合成巴马汀、小檗碱、白屈菜红碱、血根碱和白屈菜玉红碱等BIA 分子。在此过程中，采用重定位 BBE 至内质网，显著提高了其催化产物含量。同时验证了DBOX 可以催化四氢原小檗碱和二氢苯并菲啶生物碱的双电子氧化。最后通过优化DBOX 的表达减轻了其对 BBE 活性的抑制。该研究强调了酵母细胞工厂通过异源重构植物酶生产多种 BIA分子的潜力。

图 1. 两类生物碱途径重构示意图

1. 构建生产(S)-norcoclaurine的平台菌

(S)-norcoclaurine生源途径中第一个具有 BIA 骨架的中间体，同时也是所有 BIA 分子的共同前体。作者首先将最优的酪氨酸羟化酶（筛选结果发现最优者是CYP76AD5）、去甲乌药碱合酶（筛选结果发现最优者是CjNCSΔ35）以及多巴脱羧酶（DODC），并且过表达了酵母内源基因ARO1、ARO2、ARO3, 表达了来源于大肠杆菌的EcaroL 、来源于苜蓿的MtPDH1 和两个突变体Aro4K229L 和 Aro7G141S，从而初步构建了能够生产(S)-norcoclaurine 的菌株XJ053，产量为 23.4 mg/L。

此时发酵液中还残留大量前体的剩余，为了进一步推动前体转化为(S)-norcoclaurine，作为采用了三个策略：①将CjNCSΔ35 和Aro10 封装到细菌纳米隔室中，该策略仅导致产量的极少量增加；②基于过氧化酶体的区室化，但该策略反而使产量显著减少；③敲除 4-HPAA 上游的一些竞争性的醛还原酶，该策略略微增加了产量。

接着作者增加了两个 NCS 拷贝，使得产量迅速增加了两倍，达到 214.8 mg/L。为了进一步提高 4-HPAA 的产量，筛选到 PsAAAD 具有最好的形成 4-HPAA的效果，从而得到产量为 295.5 mg/L的菌株 XJ0633。最后作者在酵母中引入植物的酪氨酸途径基因，经过不同组合的酪氨酸途径酶的整合后，产生 XJ0636菌株，其(S)-norcoclaurine 产量达到 315 mg/L。该菌株作为后续步骤的平台菌。

图 2. (S)-norcoclaurine 平台菌的构建

2. 构建生产(S)-reticuline 的平台菌

(S)-reticuline 是包括原小檗碱型和苯并菲啶型在内的众多重要 BIA 分子的共同前体。作者筛选了罂粟、花菱草和延胡索来源的 6OMT、CNMT、NMCH，发现来源于罂粟的 Ps6OMT 和 PsCNMT、来源于延胡索的 CyNMCH 是最佳组合。随后，为了进一步提高 P450 的活性，筛选了不同来源的 CPR，发现拟南芥的 ATR1 是与 NMCH 配对最好的 CPR，(S)-reticuline 产量达到 273.6 mg/L。但此时发现中间体产量仍然较多，作者采用“landingpad system for precise multicopy gene integration”，最后获得整合了2拷贝的 Ps4’OMT 和 5 拷贝的 CyNMCH 的 XJ0691 能够产生最多的(S)-reticuline，产量为 425.2 mg/L。

图 3. (S)-reticuline 平台菌的构建

3. 改造 BBE 以提高其在酵母中的活性

BBE 催化(S)-reticuline 的 N甲基氧化环化成(S)-scoulerine，这是1-BIA 形成原小檗碱和苯并菲啶生物碱的关键步骤。作者选择四种不同来源的 BBE，利用低(S)-reticuline 产量的 XJ048 进行测试，发现来源于延胡索的 CyBBE 具有最好的活性，但是底物的含量依然高于产物约 2 倍。

BBE 的最佳pH 为 8.9，且之前的报道表明其含有内质网信号肽和液泡分选信号，所以 BBE 的最终定位于液泡，而液泡的 pH应为酸性。作者假设这导致了 BBE 的低活性，利用 BBE 的重定位解决这一问题。酵母中，线粒体基质 pH 为 7.0-7.5，细胞质和内质网pH 约为 7.0，高尔基体的 pH 从cis-Golgi到trans-Golgi 逐步下降（6.5-6.0）。作者分别去除内质网信号肽（variants CyBBEΔ29和CyBBEΔ46）、去除内质网信号肽和液泡分选信号、去除液泡分选信号但保留内质网信号肽，结果发现三种改造都不能产生任何产物。荧光和 WB 分析表明这些改造使得 BBE 不能进行转运和翻译后修饰，导致失活。

随后作者改变 BBE 的信号肽，使 CyBBE 从高尔基体返回到内质网或者使其保留在高尔基体中，而不是运输到液泡中。作者在 BBEC 端加上内质网C 端 HDEL 肽（CyBBE_ERTS）来将其改造成内质网内腔可溶性蛋白，或者在其 N 端加上 118 个氨基酸的高尔基体靶向序列（GOTS_CyBBE），在 XJ0691 中测试两个变体，发现与野生型相比，其产量分别提高了 206% （(S)-scoulerine 产量为 76.5 mg/L，菌株编号 XJ0695）和 33%。共定位显微镜显示野生型 BBE 被运输至液泡中，CyBBE_ERTS 被重定向至内质网中，GOTS_CyBBE 保留在高尔基体中。进一步的，作者进行了 RT-qPCR、WB 、体外不同 pH 的酶活测试以及分子动力学模拟等实验来比较CyBBE_ERTS与野生型之间的差异。结果发现CyBBE_ERTS 与野生型的表达水平相近，表明其活性增加两倍是因为酶活增加而不是表达水平增加。PNGaseF 处理的CyBBE_ERTS 的WB 实验表明其与野生型经历了类似的后修饰。体外不同 pH 的活性测试表明较高的 pH 更有利于 BBE 的催化活性。分子动力学模拟表明 C 端的 HDEL 更加有利于 CyBBE 的稳定性。综上各种实验结果，作者认为内质网靶向策略保证了 BBE 通过分泌途径进行适当加工和后修饰，同时该策略可以将其逆行至内质网，从而提供有利的微环境，从而提高其活性。

此时(S)-scoulerine 产量虽然提高了，但是底物 reticuline 仍然超过 100 mg/L。作者考虑到 reticuline 是在培养基中检测到的，为了提高底物利用率，作者表达了来自罂粟的两个BIA 转运蛋白 PsPUB1 和 PsBUP1 和 PsBUP6，之前报道表明其可以将细胞外的 BIA 转运至细胞内容，然而在作者的实验中并没有观察到(S)-scoulerine 产量的变化。作者又通过多种改造使 4’OMT 与 CyBBE_ERTS 在空间上更加接近，然而均不能提高(S)-scoulerine 产量，这表明底物可用性可能并不是制约产量进一步提高的因素。接着，作者又增加了野生型 BBE 、CyBBE_ERTS 或GOTS_CyBBE 的拷贝数，(S)-scoulerine 的产量反而不同程度下降了。

之前的研究表明产物(S)-scoulerine 和过氧化氢会抑制 BBE 的活性。由于(S)-scoulerine 被分泌至胞外，所以作者主要通过表达过氧化氢相关酶来进行 H2O2 的清除，当表达α-mPRDX4_ERTS 时，(S)-scoulerine 的产量提高到 98.4 mg/L。最后作者又通过内质网区室化、扩增内质网、减轻 H2O2 的反馈抑制，使得(S)-scoulerine 产量达到 113.1 mg/L，菌株编号 XJ0843。

图 4. 酵母中BBE 活性的提高

4. 酵母中原小檗碱型生物碱的从头合成

本节中作者主要目标是合成两种原小檗碱型生物碱：巴马汀和小檗碱。作者首先在遗传背景简单的 XJ083 菌株中筛选了不同来源的 S9OMT 和 CoOMT，确定了来源于唐松草的 TfS9OMT 和来源于延胡索的CySOMT 是将(S)-scoulerine 转化为四氢巴马汀(S)-tetrahydropalmatine的最佳组合。将以上组合整合至平台菌 XJ0691 中，生成四氢巴马汀产量为 68.6 mg/L 的 XJ0839。巴马汀由四氢巴马汀失去四个电子形成两个双键而来。已经有报道报名 STOX 和 DBOX可以催化这类反应，但是至今还没有在酵母中验证其功能的报道。作者选择了六个不同来源的密码子优化的 STOX（AmSTOX、BwSTOX、CjTHBO、PsFADOX5、McDBOX1和McDBOX2）和 4 个融合体HPA2-AmSTOX、ySOMT-AmSTOX、HPA2-PsFADOX、, CySOMT-PsFADOX5 整合至前体菌中，包括对照组在内的所有菌株都产生了极少量的巴马汀，表明巴马汀可能是自发产生的。然而在表达 McDBOX1 和 McDBOX2 的菌株中可以检测到明显的二氢巴马汀，经过化合物稳定性、保留时间和质谱比较，确定其应为 13,14-二氢巴马汀，而不是不稳定的7,8-二氢巴马汀，同时可以检测到针对 scoulerine、tetrahydrocolumbamine的二氢产物。最后作者通过加热发酵产物 4 小时和 36 小时，分别获得了14.3和 54 mg/L的巴马汀。在底盘菌中引入 CAS 和 McDBOX2并经过加热，同样可以获得小檗碱。

图 5. 巴马汀和小檗碱途径

5. 酵母中苯并菲啶生物碱的从头合成

来源于花菱草和延胡索的 CFS和 SPS 以不同组合与 PsTNMT、PsMSH 一起整合至底盘菌XJ0695 上，结果表明 EcCFS和EcSPS 的组合具有最好的生产 protopine 的活性。接着将上文提到的6 个 FAD 依赖的氧化酶分别与 EcP6H 一起整合至酵母产 protopine 的菌中。WB 分析显示 BwSTOX、McDBOX1和McDBOX2 表达良好， PsFADOX5 条带弥散，其他不表达。包括只整合了 EcP6H 在内的所有菌中都检测到了血根碱，这与之前的报道一致，表明氧化步骤可以自发发生或由内源氧化酶催化。但在 McDBOX2 的菌（XJ0750）中二氢血根碱消失，产生了血根碱的量最高。

血根碱的衍生物chelirubine 亦有很好的药理效果，作者又在上述菌株的基础上发现了 C10 位羟化酶和甲基转移酶，实现了chelirubine 从头生物合成。接着，作者在上述结果的基础上，继续在产(S)-scoulerine的菌中整合TfS9OMT*, CAS, PsTNMT, PsMSH, EcP6H 和McDBOX2，实现了白屈菜红碱chelerythrine的从头合成。

6．DBOX表达的优化

在上述实验中，表达了 McDBOX2 的菌株生物量均有下降，且(S)-reticuline 的量会上升，这表明McDBOX2 的表达可能影响了 BBE 的活性。但是在本研究中，BBE 被重定位到内质网，而McDBOX2 定位在液泡中，空间上应该不存在冲突。另外可能产生的冲突有①都是FAD 依赖；②都产生副产物 H2O2；③都需要冲内质网转运至高尔基体。其中 H2O2 在液泡中产生，应该不影响内质网中的 BBE，因此考虑另外两种因素。首先作者通过质粒在酵母中表达各种 FAD转运体，发现与空载相比，转化了MCH5 或BsRibc 的菌株白屈菜红碱的产量增长了 24% 和 39%，但并没有减少(S)-reticuline 的积累量，表明这些转运体是提高了 DBOX 的功能，而不是减少了 BBE 的抑制。针对第③点的验证没有取得目标结果。

最后作者尝试通过区室化 McDBOX2 来规避冲突。首先将 McDBOX2 定位只内质网，WB 显示其在内质网中表达良好，然而这并没有减少(S)-reticuline 的积累量。接着，作者截断了其 N 端的 29 个氨基酸使其胞质表达，结果发现与不表达 McDBOX2 的菌株相比其 OD600和(S)-reticuline 的积累量均相似，与表达完整 McDBOX2 的菌株相比，(S)-reticuline 的积累量减少，OD600 上升。这表明McDBOX2Δ29一定程度上减少了对 BBE 的抑制。最终整合以上策略，获得了 XJ07472 和 XJ07502 菌株，其白屈菜红碱和血根碱产量分别为 38.1 mg/L和 3.8 mg/L。

图 6. 通过多种策略解除 McDBOX2 的表达对 BBE 功能的抑制