贯叶连翘（Hypericum perforatum）是金丝桃科、金丝桃属多年生草本植物，俗称圣约翰草，被广泛用于治疗抑郁症，被称为“天然氟西汀”。褪黑素具有调节动物昼夜节律、季节性生殖发育、增强免疫力和改善睡眠的功能；褪黑素于1995年首次在陆生植物中被发现，然而，有关植物褪黑素生物合成调控的研究仍处于早期阶段，目前尚不清楚植物内源生物钟系统是否与脊椎动物类似参与调节褪黑素的生物合成。
2024年9月18日陕西师范大学王喆之/周文团队在Science Advances期刊发表题为”Clock protein LHY targets SNAT1 and negatively regulates the biosynthesis of melatonin in Hypericum perforatum”的研究论文。该研究中，作者发现贯叶连翘中褪黑素含量和褪黑素生物合成限速酶5-羟色胺-N-乙酰转移酶（SNAT1）表达量在24小时周期内振荡，利用酵母文库筛选到与HpSNAT1启动子结合的转录因子HpLHY，HpLHY能够直接靶向结合HpSNAT1启动子区域EE Motif抑制HpSNAT1的表达与翻译水平，首次解析了生物钟蛋白对贯叶连翘中褪黑素昼高夜低节律性的调控机制。
图 1. 贯叶连翘中的褪黑素和HpSNAT1信号传导显示出昼夜节律
在12L/12D光周期中，贯叶连翘的内源褪黑素表现出明显节律性，其中HpSNAT1的表达与褪黑素浓度变化相似，WT和OE-HpSNAT1转录组测序后发现二者存在明显差异，表明HpSNAT1基因与褪黑素昼夜节律密切相关。
图2 HpLHY的生物信息分析和亚细胞定位
利用酵母文库筛选出与HpSNAT1启动子互作的转录因子HpLHY，LHY位于细胞核，通过qPCR分析HpLHY在花中表达量最低，在茎中表达量最高；同时在24h（12L/12D）光周期内HpLHY基因的表达趋势为与HpSNAT1的表达趋势相反。
图 3 HpLHY与EEmotif结合来抑制HpSNAT1的表达
利用Y1H和EMSA（电泳迁移试验）验证HpLHY与HpSNAT1启动子P1段EE motif（AAATATCT或AGATATTT）结合，接着通过双荧光素酶报告系统进一步验证HpLHY负调控HpSNAT1的表达。
图 4 贯叶连翘HpLHY的过表达和基因敲除
与沉默LHY植株（KO）相比，过表达LHY转基因植株（OE）表现出明显生长迟缓，通过探究HpLHY在不同转基因体系中的转录和翻译水平，发现HpLHY在OE株系中基因表达和蛋白反义水平都有所提高，而KO株系则相反。OE株系褪黑素含量明显降低，而KO株系则褪黑素含量的增加。
图 5 不同转基因体系中贯叶连翘表型的变化和褪黑素积累
通过检测不同转基因在12 L/12D光周期条件下的褪黑素含量。对照组（EV）褪黑素的积累仍具有节律性，在KO株系中，这种节律的几乎消失；OE株系的褪黑素水平大幅下降，并表现出异常节律。HpLHY抑制了HpSNAT1基因的表达，导致褪黑素积累减少。
图 6.贯叶连翘中昼夜节律调控因子LHY与褪黑素生物合成的关系
该项工作首次解析了生物钟蛋白对贯叶连翘中褪黑素昼高夜低节律性的调控机制。其中，LHY能够直接靶向结合EE Motif抑制褪黑素生物合成限速酶5-羟色胺-N-乙酰转移酶的表达与翻译水平。该研究对褪黑素合成调节领域提供了重要的科学依据。
陕西师范大学王喆之教授为该论文通讯作者，周文副研究员该论文的第一作者，该研究得到了国家自然科学基金（32100308 和32170378）的支持。
原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adq6505
