2024年10月2日，中国中医科学院医学实验中心皮肤健康研究团队在期刊Journal of Photochemistry & Photobiology, B: Biology发表了题为“Acne-related UVA-induced facial fluorescence: An exploratory study from physiological properties to tissue structure information”的研究论文。
紫外线荧光成像为痤疮的检查提供了一种新的方法。UVA诱导的面部红色荧光一直归因于粪卟啉III（CPPIII）和原卟啉IX（PPIX）。一些重要研究将紫外线荧光作为痤疮诊断评估和治疗监测的工具。然而，这些结果的可靠性备受争议。事实上，荧光成像中还有大量信息有待发掘。例如，角蛋白相关荧光团在370 nm波长下激发时会发出白色荧光。黑色区域和亮蓝色物质分别代表色素沉积和外源物质。如果能够阐明UVA 诱导的面部荧光（UVAF）的各种颜色的来源及其与痤疮严重程度的关系，将大大提高痤疮诊断和治疗的准确性和有效性。
本研究使用MIDOO 智能皮肤成像设备采集荧光图像，并在CMOS传感器前放置长通滤波器（≥525 nm）。评估了不同颜色的荧光与痤疮皮损之间的相关性。此外，还根据生理特性和结构信息分析了荧光的物质来源。
面部绿色荧光与非炎症性痤疮皮损密切相关
绿色荧光计数与额头、鼻子、左脸颊和右脸颊上的非炎症性皮损（粉刺）之间存在密切联系，相关系数在0.432 至0.838 之间。相反，绿色荧光与炎症性痤疮皮损之间没有相关性。无论痤疮皮损是炎症性还是非炎症性，橙红色荧光计数与痤疮皮损之间都没有相关性（图1）。
图1. 痤疮皮损类型与橙红色和绿色荧光数量之间的相关性
毛囊内容物的定性和定量分析
提取健康受试者鼻头部位毛囊内容物，分离橙红色荧光和绿色荧光内容物，并分别进行体外荧光光谱检测。首先，365nm激发波长测量角蛋白水溶液（5%）的荧光光谱，在460nm处获得特征峰（图2A）。提取绿色荧光与橙红色荧光毛囊内容物蛋白，给予365nm激发波长时，绿色荧光与橙红色荧光毛囊内容物在460nm具有发射峰。不同的是，绿色荧光物质荧光强度高于橙红色荧光物质（图2A）。因此，我们推测绿色荧光毛囊内容物中含有更高浓度的角蛋白。CPPIII和PPIX标准品在365nm激发时，分别在620nm和630nm具有发射荧光峰（图2B）。通过对绿色荧光物质与橙红色荧光物质提取卟啉处理，给予365nm激发，检测到2个主要峰，分别为约590nm和620-630nm。显而易见，橙红色荧光物质的荧光强度大于绿色荧光物质，橙红色荧光毛囊内容物中含有更多的卟啉（图2B）。蛋白免疫印迹结果提示，绿色荧光物质中K6和K16的表达水平明显高于橙红色荧光物质（图2C）。UHPLC-MS结果提示，橙红色荧光物质卟啉含量是绿色荧光物质的5倍（表1）。
图2.毛囊内容物中角蛋白和卟啉的定性和定量分析
UVAF 的绿色荧光来自角蛋白
绿色荧光与粉刺病变具有较高的相关性，当开口粉刺暴露在空气中时发出强烈的绿色荧光（图3A）。为了揭示荧光来源，我们分离出了完整的粉刺角栓，并对它的组织结构进行观察。我们发现完整的粉刺栓子在UVAF成像中显示出橙红色和绿色两部分荧光（图3A），并且具有明显的分界，病灶表面UVAF颜色以绿色为主，非病灶部位以红色为主。
通过对粉刺角栓进行组织学染色，发现粉刺角栓是一个包裹着油脂的角质板层结构，角质板层中K16具有阳性表达，角栓的顶部同样存在K16的阳性表达。除此之外，我们还在扫描电镜下观察了粉刺角栓的细微结构，除了油脂，角质板层中还存活着大量的微生物（图3C）。以上结果提示粉刺角栓是一个成熟的由角蛋白、脂质和微生物组成的复杂结构，角蛋白外壳可能是荧光的来源。除此之外，我们还通过TPEF定义了粉刺角栓的内部成像。用光谱探测器进行了补充测量，然后根据不同的荧光信号将图像分为几个区域（图3D）。有趣的是，粉刺角栓(顶部)呈现出与角蛋白参考光谱紧密对应的荧光轮廓，其发射峰位于460nm (蓝色曲线,图3D)附近。该信号进一步解释了绿色荧光来自于角蛋白。
我们对分离出的整个粉刺角栓也在TPEF下进行了观察，无论是对粉刺角栓进行光学切片还是叠加图均发现角栓外壳以绿色荧光为主，特别是角栓的顶部绿色荧光更加突出（图3B）。这也解释了面部荧光图像中开口粉刺发出的绿色荧光来源于粉刺角栓的角质化外壳。图3B展示了粉刺角栓在双光子显微镜下沿Z轴扫描的merge图像，我们将整个角栓分割为绿色区域和橙红色区域。
UVAF 的橙红色荧光来自卟啉
除了卟啉被认为是橙红色荧光的起点，很多学者认为皮脂也可能是橙红色荧光的起源。但有研究证明人的皮脂、皮脂腺和皮脂细胞不发射橙红色荧光,毛囊内的常驻细菌是主要来源。为了验证粉刺角栓中的橙红色荧光是细菌发出的，我们分割出了粉刺角栓的橙红色区域，分别在有氧条件和厌氧条件下分离培养出细菌。在5-ALA诱导下部分菌落发出橙红色荧光（图3E）。紧接着，将具有荧光的菌落量紫外荧光光谱在622nm出现发射峰（图3F）。因此，细菌内源性卟啉产生是粉刺角栓橙红色荧光的主要来源。除此之外，MALDI-TOF MS的结果显示，有氧条件和厌氧条件下分离培养出的荧光菌株经鉴定为表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis, S.epidermidis) （图3G）。
图3.对粉刺栓的结构分析和细菌鉴定揭示了面部橙红色和绿色荧光的来源
橙红色荧光可能是毛囊通畅的象征
橙红色荧光常见于健康人的鼻翼两侧，同时与痤疮病变无相关性。橙红色荧光由卟啉发出，虽然卟啉在痤疮发生进程中扮演促炎因子的角色，但我们推测这种情况被通畅的毛囊排除在外。所以，健康的鼻子两侧尽管有橙红色荧光发生，但不具有致病力。相反，绿色荧光与角质化程度过高密切相关，过度角化使毛囊闭塞，最终形成粉刺和炎症性痤疮病变。因此，我们提出假设，橙红色荧光可能是毛囊通畅的象征。我们对一名受试者进行荧光成像后，选择2cm×2cm面部区域，该区域以绿色荧光和开口粉刺为主。使用甘醇酸治疗， 24h后采集受试者的荧光图像，我们发现甘醇酸使用后红色荧光数量增多，绿色荧光数量减少（图4A）。接下来，我们对分离提取的毛囊内容物进行组织切片，HE染色可见散碎的皮肤角质未形成连续的角质板层结构，并且油红O染色可见大范围散在的脂滴（图4B）。同时，提取鼻翼部位的毛囊内容物，在有氧条件下分离培养细菌，经5-ALA刺激后，菌落发生卟啉荧光，经菌落鉴定为S.epidermidis（图4C）。因此在健康人的鼻翼部位，毛囊内分泌物，包括皮脂和卟啉，可以及时代谢并排出体外而不易形成痤疮。
图4.橙红色荧光与毛囊的通透性密切相关
本研究利用365nm紫外滤光片的照明模式并在CMOS传感器前端放置了一个长波长滤光片( ≥ 525 nm )，清晰的反映了面部皮肤橙红色和绿色荧光点。通过深入挖掘面部荧光的生理特性信息和结构信息，揭示了不同颜色面部荧光的来源，橙红色荧光来源于毛囊中的细菌的代谢产物卟啉，绿色荧光来自于角蛋白，表征了毛囊角化。首次解释了橙红色荧光与毛囊通畅的关系。但本研究仅仅发现通过乙醇酸处理，畅通的健康毛囊与卟啉的橙红色荧光之间的关系，没有进一步探讨卟啉的致病性及其与毛囊内各种微生物的相互关系。总之，我们的研究有利于更全面地了解UVAF与痤疮的关系，为痤疮严重程度评估提供了更加客观的检测方法。未来的研究中，我们将揭示荧光与痤疮相关菌群的关系，从微生态角度提供更多的与痤疮严重程度评估相关的检测方法。
本研究由中国中医科学院医学实验中心皮肤健康研究团队设计并完成，博士研究生任星为文章第一作者，王毅研究员、孙娅楠副研究员为通讯作者，清华大学国际研究生院何宏辉教授、研究生张钰新，北京中医药大学研究生周娜、王羽侬，北京汇智合一生物科技有限公司舒哲，以及中国中医科学院医学实验中心李贤煜研究员、李俐霜、高欣雨、马语蔓参与了相关工作。本研究获得了国中医科学院科技创新工程中西医结合基础重大攻关项目、中国中医科学院科技创新工程“中医药新技术新方法学科”创新团队等项目基金资助。
