金鸡纳生物碱（Cinchona alkaloids）类成分主要由金鸡纳属（Cinchona）植物产生，其结构多样，代表性成分奎宁（quinine）长期用作抗疟药和一种苦味剂成分，奎宁的异构体奎尼丁（quinidine）、去甲氧基类似物辛可尼丁（cinchonidine）和辛可宁（cinchonine）等不仅具有药理价值，在合成化学中也被用作手性催化剂和添加剂。目前虽已经报道了许多金鸡纳生物碱的总合成，但该类化合物的生物合成仍较大程度未被阐明。近日，德国马普化学生态研究所Sarah E. O’Connor教授团队在bioRxiv上发表了题为Biosynthetic Origin of the Methoxy Group in Quinine and Related Cinchona Alkaloids的研究进展https://doi.org/10.1101/2024.09.24.614729。![]()
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传统认为的金鸡纳生物碱生物合成途径（左图）和本研究提出的生物合成途径（右图）
普遍认为奎宁的生物合成步骤中甲氧基化过程是在后期阶段，该步骤需要先进行羟基化再进一步甲基化而形成，因此作者首先根据转录组筛选了150个候选氧化酶（P450s、BBE和PPOs），以中游及下游途径中的cinchonidinone（15a）、cinchoninone（15b）、异胡豆苷（strictosidine，12）等多个中间体作为底物，利用烟草瞬时表达体系验证候选氧化酶功能，均未检测到羟基化活性。为深入了解甲氧基化发生在哪个阶段，作者对鸡纳树（Cinchona pubescens）幼嫩的根茎叶三个组织进行代谢组检测，结果显示带有甲氧基和去甲氧基的相关成分均存在，提示存在两个平行的生物合成途径：一个以甲氧基前体为底物，一个以去甲氧基前体为底物。由于代谢组中检测到5-甲氧基色胺（serotonin，21），未检测到5-甲氧基色胺酸，再者未在转录组中注释到色胺酸羟化酶的同源基因，作者推测该甲氧基化步骤是以色胺为底物生成5-甲氧基色胺。为验证该推测，作者首先通过blast筛选到15个候选色胺-5-羟化酶（T5H），烟草体系鉴定到CpT5H1和CpT5H2可以催化色胺产生5-羟色胺。进一步筛选了7个候选羟基吲哚-O-甲基转移酶验证甲基化活性，利用大肠验证体系发现仅CpOMT1可以催化5-羟色胺生成5-甲氧基色胺（Fig. 1a），且催化效率高于6’- hydroxycinchoninone为底物，进一步利用烟草体系鉴定该活性，发现烟草中仅能以5-羟色胺为底物，说明CpOMT1的天然底物为5-羟色胺。为了研究CpT5H1/2和CpOMT1如何影响植物中甲基化和去甲基化产物的比例，解析下游酶CpDCS和CpDCE是否可以同时产生下游甲氧基和去甲氧基产物，作者首先确定了鸡纳树中CpSTR具有翻转色胺和5-甲氧基色胺的活性，并鉴定到非途径上的两个还原酶CpTHAS1/2。随后，作者利用烟草体系将CpT5H、CpOMT1、CpSTR、CpDCS、CpDCE、CpTHAS1和长春花中CrSGD共表达，共注射色胺和裂环马钱子苷（secologanin，11）为底物，共检测到9个包括甲基化和去甲基化的产物（Fig. 1c），其中dihydrocorynantheal型产物相对较少（Fig. 1d），可能是由于前体产生在液泡中，不能很好的被下游催化酶催化，因此作者在此基础上引入了异胡豆苷转运蛋白CpSTTr提高了其产量（Fig. 1e）。![]()
最后，作者利用同位素标记获得色胺-(indole-d 5)和5-甲氧基色胺-(O-methyl-13C, d3)，体外饲喂金鸡纳幼株的茎和叶，最终检测到携带标记的奎宁、奎尼丁及其他相关生物碱，进一步证明奎宁等带有甲氧基生物碱来源于5-甲氧基色胺，而去甲氧基的生物碱来源于色胺。综上，该研究发现奎宁和相关金鸡纳生物碱中的甲氧基被引入至起始底物色胺，植物中5-甲氧基色胺可以被用作合成奎宁的中间体。并在烟草中重构生物合成的早期步骤获得甲氧基化和去甲氧基化的金鸡纳生物碱中间体，证实了色胺与5-甲氧基色胺可以同时作为底物合成鸡纳树中甲基化的和去甲基化的生物碱类成分。这项工作为利用合成生物学技术生产高价值的金鸡纳生物碱奠定了基础。
