本研究主要目标是阐明中药黄芪(Astragalus membranaceus)中主要活性成分黄芪甲苷(Astragaloside IV, AG IV)的完整生物合成途径。黄芪是一种已有2000多年使用历史的中药,其主要活性成分黄芪甲苷具有多种药理活性,在免疫调节、抗病毒等方面有广泛应用。然而,目前黄芪甲苷的供应仍依赖于从黄芪植物中提取,存在产量低(黄芪中AG IV含量仅为0.146 mg/g)、生产周期长等问题,限制了其在医药研究和应用中的范围。
Despite this, the biosynthetic machinery for astragalosides remains enigmatic. Here a chromosome-level genome assembly of A. membranaceus was generated.
Fig. 1 | The structure of 1 and its proposed biosynthetic pathway in A. membranaceus
阐明黄芪甲苷的生物合成机制,对于利用合成生物学手段实现其异源生产,突破原料瓶颈,推动其进一步研究开发具有重要意义。这将为开发更高效、更可持续的黄芪甲苷生产方式,推动其在药物研发、保健品等领域的应用提供新思路。
本论文从黄芪基因组出发,通过基因组挖掘、功能基因鉴定、代谢工程改造等一系列研究,首次系统阐明了黄芪甲苷的完整生物合成途径,主要包括以下创新点:
构建了高质量的黄芪染色体水平基因组序列, 为深入分析提供基础。作者利用多种测序技术,获得了1.44 Gb (contig N50: 2.82 Mb, scaffold N50: 185 Mb)的高质量基因组序列,为后续基因挖掘奠定基础。
This yielded a 1.44 Gb assembly genome with a contig N50 of 2.82 Mb and scaffold N50 of 185 Mb.
发现了一个由6个修饰酶基因(CYP450、GT、OGD)构成的生物合成基因簇(Biosynthetic Gene Cluster, BGC)。通过将两个关键基因AmCYP88D25和AmGT11定位到染色体上,作者意外发现它们位于1号染色体的一个~4 Mb的区域内,推测该区域可能存在与黄芪甲苷合成相关的基因簇。这一基因簇最终被证实由3个细胞色素P450 (CYP450)、2个糖基转移酶(GT)和1个2-酮戊二酸依赖性双加氧酶(OGD)构成,负责催化黄芪甲苷骨架的修饰。值得注意的是,该基因簇特征酶- 环化酶基因AmOSC3并不包含在内,这拓展了人们对植物萜类BGC结构多样性的认识。
It is worth noting that the AG BGC identified on chromosome 1 was composed exclusively of the six tailoring enzyme genes required for AG biosynthesis, while the signature enzyme gene, AmOSC3, was located alone on chromosome 8. (Fig. 3a)
系统鉴定了所有黄芪甲苷生物合成关键酶的功能。作者利用基因异源表达、体外酶活检测等方法,鉴定出AmCYP88D25负责C-16羟基化、AmCYP88D7负责C-6羟基化、AmCYP71D756负责24,25-环氧化、 AmOGD1负责C-20羟基化并引发后续成环反应,AmGT11和AmGT36负责骨架羟基的糖基化修饰。这些酶串联作用,驱动环三萜骨架的多步修饰,完成黄芪甲苷的生物合成。
Considered together, the experimental results indicate that the formation of 3 proceeds through an initial AmOGD1-catalysed C-20 hydroxylation of 12, followed by a non-enzymatic intramolecular attack of the nascent 20-OH onto the 24,25-epoxide (Figs. 3d,e and 4a).
利用本氏烟草(Nicotiana benthamiana)重建了黄芪甲苷的完整生物合成途径。作者将AmOSC3、3个CYP450s(AmCYP88D25、AmCYP88D7、AmCYP71D756)、AmOGD1和2个GTs(AmGT11、AmGT36)共同导入本氏烟草,成功检测到终产物黄芪甲苷IV (2.224mg/g干重),证实了所鉴定途径的正确性,也为异源生产黄芪甲苷提供了新方法。
As expected, upon expressing AmOSC3, AtCPR1 and all six tailoring enzymes identified in this study in N. benthamiana, the production of 1 was observed (0.293 mg g−1 plant dry weight; Fig. 4b and Extended Data Fig. 7). Further optimization by overexpressing the upstream triterpene precursor-forming pathway gene NbtHMGR (truncated 3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase gene from N. benthamiana) successfully increased the production of 1 to 2.224 mg g−1 plant dry weight (Extended Data Fig. 7). (Fig. 4)
黄芪甲苷生物合成途径的解析和异源重建
1. 发现编码黄芪甲苷生物合成的关键酶基因
黄芪中主要活性成分黄芪甲苷的合成需要环化酶、细胞色素P450、糖基转移酶等多个酶的协同作用。作者首先通过转录组分析,鉴定出在黄芪根中高表达的一系列候选基因:
15 CYP450 candidates showing specific or high expression in the A.membranaceus root (that is, where AGs accumulate) were selected for functional analysis (Supplementary Figs. 7 and 8).
随后,将这些候选基因在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中进行异源表达和功能验证。结果发现,AmCYP88D25催化环化产物cycloartenol (2)的C-16位羟基化,生成16-hydroxycycloartenol (6)(Fig. 2a,b);AmGT11和AmGT72能催化3-O-糖基化反应,将cyclocantogenin (3)转化为astraverrucin I (7)或astramembrannin II (5)(Fig. 2c,d,g);AmGT36则负责6-O-糖基化,将5转化为黄芪甲苷(1)(Fig. 2e)。
AmCYP88D25 was the only gene that resulted in the appearance of a new product (Fig. 2a), which was identified as 16-hydroxycycloartenol (6). Thus, AmCYP88D25 was identified as the oxidase responsible for the C-16 hydroxylation of 2 in the AG biosynthetic pathway (Fig. 2b).
图2
此外,2-酮戊二酸依赖性双加氧酶AmOGD1也能作用于24,25-epoxy-6,16-dihydroxycycloartenol (12),催化C-20羟基化反应和后续的四氢呋喃环形成步骤,生成cyclocantogenin (3)(Fig. 3d,e)。
这些酶催化功能的鉴定,阐明了从环化产物cycloartenol到黄芪甲苷的完整生物合成途径,突破了以往对该途径认识的局限。特别是CYP450酶AmCYP88D7、AmCYP71D756和双加氧酶AmOGD1的鉴定,揭示了独特的四氢呋喃环形成机制,拓展了人们对三萜类化合物骨架多样化的认知。
2. 发现参与黄芪甲苷生物合成的基因簇
在鉴定出关键酶AmCYP88D25和AmGT11后,作者惊喜地发现它们在黄芪基因组1号染色体上相邻存在,位于一个约4 Mb的区间内。推测该区域可能存在一个负责黄芪甲苷生物合成的基因簇。经进一步分析,作者鉴定出一个由AmCYP88D25、AmCYP88D7、AmCYP71D756、AmOGD1、AmGT11和AmGT36构成的基因簇(Fig. 3a)。有趣的是,三萜合成的关键酶- 环化酶基因AmOSC3并未位于该簇内,而是独立存在于8号染色体上。
Accordingly, we searched for candidate genes in the chromosomal region adjacent to AmCYP88D25 and AmGT11, which led to the discovery of two CYP450 genes (AmCYP88D7 and AmCYP71D756) and two UGT genes (AmGT36 and AmGT37) within an ~4 Mb genomic region (117864798–121948401 bp; Fig. 3a).
图3
通过对该基因簇进行功能验证,作者系统阐明了AmCYP88D7和AmCYP71D756的催化功能:AmCYP88D7和AmCYP71D756分别催化C-6羟基化和C-24,25环氧化反应,将6转化为12(Fig. 3b,c; Fig. 4a)。结合AmOGD1催化的C-20羟基化和四氢呋喃环形成反应,作者最终厘清了黄芪甲苷四环骨架形成的完整途径。
这一发现表明,除已知的特征酶外,修饰酶基因的簇状分布可能是植物三萜生物合成的普遍特征。特别是环化酶基因AmOSC3位于簇外的独特现象,对植物三萜生物合成基因簇的进化机制研究具有重要启示意义。这一基因簇的鉴定,为后续黄芪次生代谢调控、其他三萜类化合物基因簇的发掘奠定了重要基础。
3. 在本氏烟草中成功重建黄芪甲苷的生物合成途径
基于以上发现,作者构建了整合黄芪甲苷合成所需6个关键基因(AmOSC3, AmCYP88D25, AmCYP88D7, AmCYP71D756, AmOGD1, AmGT11, AmGT36)的本氏烟草表达载体,成功在本氏烟草中检测到了黄芪甲苷IV (1)的合成,含量达到2.224 mg/g干重(Fig. 4b)。
As expected, upon expressing AmOSC3, AtCPR1 and all six tailoring enzymes identified in this study in N. benthamiana, the production of 1 was observed (0.293 mg g−1 plant dry weight; Fig. 4b and Extended Data Fig. 7). Further optimization by overexpressing the upstream triterpene precursor-forming pathway gene NbtHMGR (truncated 3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase gene from N. benthamiana) successfully increased the production of 1 to 2.224 mg g−1 plant dry weight (Extended Data Fig. 7).
图4
此外,通过不同酶的组合表达,作者还观察到合成中间产物3、4、5的累积,支持 AmGT11和AmGT36分别催化3-O-糖基化和6-O-糖基化,形成两条平行的糖基化途径(Fig. 4b)。
这一结果不仅有力验证了所鉴定基因的功能,更为利用代谢工程策略实现黄芪甲苷的异源生产提供了新思路。本氏烟草中的异源表达体系,为进一步优化代谢路径、提升产量奠定了坚实基础。
4. 通过RNAi沉默实验验证相关基因的功能
为进一步验证所鉴定基因参与黄芪甲苷生物合成,作者利用 RNAi 技术分别沉默 AmCYP88D25、AmCYP88D7、AmCYP71D756、AmOGD1、AmGT11 和 AmGT36,并检测相应转基因毛状根中黄芪甲苷类化合物含量的变化。结果表明,这些基因沉默后,黄芪甲苷 IV (1)和 III 的含量均显著降低(Extended Data Fig. 5),支持它们在黄芪甲苷生物合成过程中发挥关键作用。
Consistent with the effective knockdown of the target gene in each respective RNAi line, substantial reductions in AGs production were detected (Extended Data Figs. 4 and 5).
同时,在AmCYP71D756和AmGT36沉默株中分别检测到相应底物8和5的积累(Extended Data Fig. 6),为这两个关键基因的催化功能提供了进一步佐证。
扩展图4
扩展图5
扩展图6
这些体内沉默实验,不仅从反面印证了新发现基因在黄芪甲苷合成中的重要功能,也凸显了该途径对黄芪中活性成分积累的决定性作用。这为深入理解黄芪次生代谢过程、优化黄芪甲苷生物合成提供了新契机。
小结
该研究从以下几个方面阐明了中药黄芪重要活性成分黄芪甲苷的生物合成机制:1)鉴定出多个关键酶,包括AmCYP88D25、AmCYP88D7、AmCYP71D756和AmOGD1,揭示了环阿尔廷烷三萜骨架装配的全过程;2)发现一个由6个关键基因构成的生物合成基因簇,独特的基因组分布方式为植物三萜代谢调控研究提供了新视角;3)在本氏烟草中成功重建黄芪甲苷的完整合成途径,实现了其在异源宿主中的生产,并通过RNAi沉默实验有力地验证了关键基因的功能。这些发现为阐释黄芪等药用植物中复杂天然产物的形成机制提供了系统解决方案,也为后续开展三萜类化合物的代谢工程改造、实现其可持续利用奠定了重要基础。
本研究首次系统阐明了中药黄芪活性成分黄芪甲苷的生物合成机制,将为其进一步开发利用提供新思路:
异源生产黄芪甲苷。本研究成功构建了酿酒酵母和烟草细胞的黄芪甲苷生产系统,为利用合成生物学手段实现黄芪甲苷的工业化生产提供了新途径。未来可在此基础上,通过代谢流优化、瓶颈步骤调控等手段进一步提升产量,实现可持续供给。
新型黄芪甲苷类似物的开发。黄芪甲苷糖基化过程中形成了一系列中间产物,这些化合物结构新颖,可能具有独特的药理活性。阐明生物合成途径为定向合成这类化合物、开展结构-功能研究提供了基础。
三萜生物合成研究的新靶标。黄芪甲苷特征骨架四氢呋喃环的形成涉及CYP450和OGD的协同催化,揭示了植物三萜多样化的新机制。这些新颖的修饰酶可作为探针,在其他三萜类化合物的生物合成研究中得到应用。
指导黄芪等中药材品质研究。本研究鉴定的黄芪甲苷合成酶可作为分子标记,为黄芪种质资源评价、优良种质筛选、生产过程质量控制提供新手段。
未来的进一步研究方向
异源生产体系的进一步优化。目前在本氏烟草中获得的黄芪甲苷产量仍有待提高,未来可从前体供给、代谢流优化、关键酶高效表达、产物分泌与转运等方面进行系统优化,以期获得更高产量。此外,探索其他宿主如酵母、大肠杆菌等的异源生产潜力,对比不同系统的优劣,也是后续工作的重点。
其他环阿尔廷烷(cycloartane)类化合物的生物合成研究。黄芪甲苷所属的环阿尔廷烷类三萜皂苷广泛存在于植物中,具有多样的结构和活性。本研究鉴定的修饰酶序列可为同类化合物的生物合成研究提供参考,有望推动更多环阿尔廷烷类天然产物如 Cimigenol 的生物合成途径的阐明与调控。
植物三萜生物合成基因簇的研究。本文发现环化酶AmOSC3并不位于同一基因簇内,拓展了对植物三萜基因簇结构的认识。未来有必要在更多植物中开展三萜合成基因簇的发掘和功能研究,深入理解其进化机制,为三萜类天然产物的分子改造提供新思路。
基于结构的酶工程改造。本研究鉴定的一系列修饰酶与底物的结合方式、催化机制尚待进一步阐明。后续可开展关键酶的蛋白结构解析,阐明其催化机理,并据此开展定向进化,获得具有新颖催化性能的酶,用于合成结构多样的环三萜衍生物。
黄芪次生代谢的系统解析与调控。黄芪次生代谢物质种类丰富,黄芪甲苷的合成代表了其中的一条重要分支。鉴定黄芪甲苷合成途径,为进一步开展黄芪次生代谢的整体分析奠定基础。后续可在此基础上,分析不同组学数据,构建更完善的黄芪次生代谢网络,开发新的高效调控手段,为黄芪等中药材的质量改良提供新策略。
Critical Thinking
黄芪基因组组装质量有待进一步提升。虽然作者使用多种测序技术获得了较高质量的基因组序列,但组装的连续性与完整性仍有待提高。更完整、连续的基因组序列或许能发现更多与萜类生物合成相关的基因簇。
部分修饰酶的底物特异性尚不明确。AmGT11和AmGT36对3、4、5均有糖基转移活性,但对不同底物的亲和力差异还需进一步定量分析。此外,AmCYP88D7和AmCYP71D756对中间产物8、10的催化效率如何,尚需更详细的动力学参数予以评估。这些酶学性质的深入分析,将有助于找到限速步骤,为后续的代谢工程定向改造提供依据。
生物合成关键酶的亚细胞定位有待研究。萜类化合物的生物合成通常涉及不同细胞器和区室,如细胞质、内质网、液泡等。而本研究并未涉及各关键酶的亚细胞定位分析。这些酶蛋白在细胞内的空间分布与互作方式,对于底物的传递和产物的累积具有重要影响,有必要在后续研究中予以重视。
黄芪甲苷的转运和储存机制尚不清楚。作为一种糖苷类化合物,黄芪甲苷可能需要特定的转运蛋白将其运输至液泡等储存位点。这些转运机制对于最终产物的累积具有决定性作用,但本研究尚未涉及。鉴定并利用这些转运蛋白,或许能进一步提升黄芪甲苷的合成能力。
其他修饰途径的可能性有待探索。本研究阐明的合成途径能否解释黄芪中所有黄芪甲苷类化合物的形成,还有待进一步验证。比如一些其他CYP450、GT是否参与修饰反应,形成结构更为多样的衍生物,尚需更多实验予以论证。
异源重建生物合成途径的稳定性和遗传整合有待加强。目前在烟草中的异源表达主要采用瞬时表达策略,虽然能检测到黄芪甲苷的合成,但重复性和稳定性尚需提升。后续可考虑采用基因整合等方式,获得可遗传的转基因株系,以期建立更稳定的异源生产体系。
