自然为药物发现提供了丰富的化学空间，但传统的化合物分离方法受到限制。合成生物学和基因组测序的进步使得“组合生物合成”成为可能，通过混合不同来源的生物合成酶可以创造新化合物。然而，从大量菌株中筛选活性化合物非常耗时。
图1 | 结构不可知的生物活性驱动的天然产物组合合成的工作流程
近日，哥本哈根大学研究团队于期刊Angew. Chem. Int. Ed.发表研究论文Structure-Agnostic Bioactivity-Driven Combinatorial Biosynthesis Reveals New Antidiabetic and Anticancer Triterpenoids，提出了一种基于生物活性的组合生物合成方法，通过连续筛选具有增加生物活性的酶组合来加速筛选过程。研究将这种方法应用于生产对PTP1B具有强大生物活性的三萜——PTP1B是糖尿病和癌症治疗的一个很有前途的分子靶点，证明了生物活性引导的工作流程可以通过将1000多个可能的组合缩小到5个高效候选的组合过程。这一工作流程加快了组合生物合成的命中识别，并适用于许多其他类型的生物活性天然产物，为加速药物发现提供了新策略。
三萜组合生物合成酵母平台的构建
为了在酵母中重建三萜类化合物的复杂性，需要一个可互换的平台，允许轻松组合TriTPSs和不同的修饰酶。为此，研究采用了一种工程化的亲本酵母菌株AM254，该菌株被设计用于提高三萜类化合物的产量，并允许尿嘧啶(U)、色氨酸(W)、亮氨酸(L)和组氨酸(H)的辅助选择。此外，还使用了一组自制的高拷贝数质粒载体，每个载体都带有上述四种辅助选择标记之一，以便于在同一酵母菌株中组合异源表达不同的TriTPSs和修饰酶。
利用植物TriTPSs和p450s进行第一轮组合生物合成
研究在酵母中引入四种植物源TriTPSs，成功合成了三萜类化合物骨架。由于质粒表达效率低，TwOSC1和McCPQ基因被整合到酵母染色体以提高表达。通过GC-MS确认了骨架的产生。进一步引入13种P450s增加骨架多样性，并通过筛选发现引入P450s的B-淀粉酶产生菌株表现出显著的PTP1B抑制活性，为后续产品多样化奠定了基础。
图2 | 通过第一轮生物活性驱动的三萜组合合成，发现齐墩果酸是一种有效的PTP1B抑制剂
利用代谢工程改善三萜生产
研究选择了CqBAS和CYP716AL1的组合作为基础，为了便于下一轮P450s修饰，首先建立了一个稳定产生高产量CYP716AL1衍生三萜类化合物的酵母菌株。为此，将CqBAS、CYP716AL1和TwCPR与六个甲羟戊酸(MVA)途径基因（ERG10、ERG13、tHMG1、HMG2K6R、ERG8和ERG12）以及三个提供关键2,3-氧化鲨烯前体途径基因（ERG20、ERG9和ERG1）一起整合到酵母基因组的XI-2位点。产生的酵母菌株（PTP061）能够比之前的菌株PTP017多产生40倍以上的CYP716AL1主要产物。
结构不可知的生物活性驱动的化学空间扩展
在PTP061酵母菌株中稳定高效生产CYP716AL1产物后，研究引入了剩余的12种P450s，构建了含有两种P450酶的新酵母菌株库（图3A）。对这些菌株（PTP062至PTP073）的提取物进行PTP1B抑制活性检测，初步未发现显著差异。通过高分辨率生物活性分析，鉴定出PTP061中四个具有PTP1B抑制活性的内源性组分（图3B-C）。为排除背景代谢物干扰，使用HPLC技术移除了这些组分，重新进行筛选后，发现七种酵母提取物显示出超过80%的PTP1B抑制（图3D）。其中三种菌株（PTP063、PTP066和PTP069）在稀释后仍显示出>50%的抑制效果（图3E），并被选为进一步多样化的基础。
图3 | 第二轮生物活性驱动的三萜组合合成
在第三轮多样化中，研究引入了除CYP716AL1外的12种P450s至上述三种酵母菌株中，构建了33个新菌株并进行筛选。其中三种菌株（PTP078、PTP079和PTP081）显示出轻微的PTP1B抑制改善，均源自PTP063菌株，并引入了CYP712K1、CYP716A141或CYP716E41作为第三种P450（图4D）。其他两个起始菌株的多样化结果未显示明显的生物活性改善（图4E-F）。最后，研究对PTP078、PTP079、PTP081、PTP087和PTP097产生的生物活性代谢物进行了分离和表征（图4D-F）。
图4 | 第三轮生物活性驱动的三萜组合合成
高通量PTP1B抑制分析，用于快速识别单个生物活性代谢物
通过液相色谱-高分辨率质谱（LC-HRMS）分析和核磁共振（NMR）鉴定，研究从五种酵母菌株中快速识别并纯化了20个三萜类化合物。这些菌株表达CqBAS、CYP716AL1和不同的P450酶。其中，PTP078、PTP079和PTP081菌株中鉴定出具有强烈PTP1B抑制作用的2β, 3β-二羟基齐墩果酸。CYP712K1转化的PTP063菌株产生了五种含C-29氧化的三萜类化合物，其中两种为新化合物。PTP078中还发现了与PTP1B抑制相关的次要峰，但未能成功纯化。PTP079和PTP081中鉴定出在特定位置羟基化的三萜类化合物，表明CYP716A141和CYP716E41的作用。
图5 | 对5株具有较强PTP1B抑制作用的酵母菌株的EtOAc提取物进行高分辨率PTP1B抑制谱和代谢物结构鉴定
PTP087和PTP097菌株产生了在C-23位置氧化的三萜类化合物，与CYP72A68的活性一致。PTP087中鉴定出新化合物21，它是由齐墩果酸与蚁酸通过非酶促反应形成的混合物。这一发现揭示了宿主生物体中修饰酶与内源酶或底物相互作用的可能性，从而扩展了化学空间。PTP097菌株也分离出具有PTP1B抑制活性的新化合物22。
PTP1B抑制活性评估和分离物的结构-活性关系（SARs）
研究评估了20种纯化的三萜类化合物对PTP1B的抑制活性，发现C-28和C-29羟基化组合在化合物5中具有显著的协同效应，表现出最强的抑制作用，IC50值为1.4±1.3μM；C-16位置的羟基化在化合物15中显示出独立的重要性，而C-23位置的羟基化则增强了齐墩果酸的抑制效果；新结构21也展现出强大的PTP1B抑制活性，IC50值为1.8±0.1μM，可能通过一种新的结合模式与PTP1B作用。此外，研究认为未来应关注提高这些分子对PTP1B的选择性，以减少潜在副作用并提高其在药物开发中的安全性。
图6 | A)单个三萜的生物合成和生物活性评价；B)化合物20到21在对照菌株AM254的酵母培养基中的非酶转化
本研究提出了一种结合代谢工程和生物活性分析的组合生物合成方法，成功地在酿酒酵母中生产了具有PTP1B抑制活性的三萜类化合物，包括五种新化合物。此工作流程可以应用于其他类型的生物活性天然产物，从而可能加速新化学实体的发现。
文献来源：
https://doi.org/10.1002/anie.202416218
