2024年8月12日，南京师范大学黄和院士团队在《Gut Microbes》发表文章“Symbiotic biofilms formed by Clostridioides difficile and Bacteroides thetaiotaomicron in the presence of vancomycin”（Q1, IF=12.2），发现万古霉素（VAN）环境下艰难梭菌（CD）与多形拟杆菌（BT）成协作关系，BT为CD提供共生生物膜从而遏制抗生素对CD的杀伤；靶向删除宿主肠内BT含量可能会提高VAN在艰难梭菌感染（CDI）治疗中的实际功效，这为基于菌群精准调控来治疗临床CDI提供了新的见解。杨靖鹏副教授、研究生芮雯、钟赛薇为论文第一作者，李亚楠副教授、黄和院士为论文通讯作者，南京师范大学为唯一通讯单位。
摘 要 万古霉素（VAN）在初发性艰难梭菌感染症（pCDI）中的治疗存在着一定的复发比例，背后原因有多种，包括生物膜诱发的反复感染。艰难梭菌（CD）能够与肠内其它物种形成单生生物膜或共生生物膜，这些生物膜能够保护CD免受抗生素的杀伤。本研究中，我们分析了VAN环境下多形拟杆菌（BT）和CD之间的生态关系及共生生物膜形成情况，发现VAN环境下CD与BT所形成的共生生物膜产量明显高于CD、BT单生生物膜。在共生生物膜中，CD的毒素蛋白TcdA和TcdB产量提高、毒力基因tcdA和tcdB表达量上调，细菌细胞游动动力和c-di-GMP含量增加，对Caco-2细胞的粘附力增强。SEM结合CLSM结果表明该共生生物膜厚度升高，致密，混合菌体量增多，而FISH探针与平板菌落计数结果则进一步说明共生生物膜中CD菌体细胞含量显著增多，能够更好的耐受模拟肠液的杀伤。综合来看，在VAN环境下CD与BT成协作关系，靶向删除或削弱宿主肠内BT含量可能会提高VAN在CDI治疗中的实际功效。
研究背景
艰难梭状芽胞杆菌（CD）作为肠道中常见的条件性致病菌，在肠内稳态失衡的情况下可产生两种具有致病作用的毒素蛋白A和B，二者能够协同破坏肠上皮细胞，进而诱发肠道炎症和组织损伤，这一现象称为艰难梭菌感染（CDI）。对于初发性艰难梭菌感染症（pCDI），通常采用一线抗生素进行治疗，包括万古霉素（VAN）与甲硝唑（MTR）的使用，但伴随着较高的复发比例，且复发性感染更加难以治愈。这一现象背后的主要原因包括顽固性孢子的形成、耐药菌株的产生、以及肠内生态紊乱所导致的机会主义微生物感染等。生物膜的存在也是导致艰难梭菌感染与复发的主要原因之一，包括CD形成的单生生物膜以及CD与肠内其他物种形成的共生生物膜。多项研究表明生物膜的存在能够有效提高CD对抗生素和宿主免疫杀伤的抵抗力。
我们在前期研究中发现CD与小鼠肠道中Bacteroides丰度呈高度正相关。在VAN治疗前后pCDI小鼠肠道中的Bacteroides丰度，特别是BT占比仍然较高，且复发感染小鼠肠道中BT也保持着较高水平。因此，我们推测在VAN环境下BT可能与CD之间存在协作关系，而这种生态互助模式可能削弱了VAN对CD的实际杀伤作用或者为抗生素环境下CD的生存、定殖及再次感染提供了支持。本研究中，我们探究了CD与BT在VAN环境下的生态互作及共生生物膜形成情况，评估共生生物膜中CD多项重要生物学指标的变化，旨在揭示VAN治疗下部分CDI反复感染与这两种微生物及其共生生物膜之间可能存在的关联，同时为靶向调控肠内BT含量来增益万古霉素在CDI中的实际疗效提供一些参考依据。
图文赏析
图1. VAN环境下CD与BT单独及共培养时的生长、生物膜产量和AI-2产量。A. CD与BT在不同浓度VAN环境下单独及共培养时的生长情况（生物量）；co，CD与BT共培养；B. CD与BT在不同浓度VAN环境下单独及共培养时的生物膜产量；co，CD与BT 共培养；C. CD与BT在不同浓度VAN环境下单独及共培养发酵上清液中AI-2含量；co，CD与BT共培养；D. 不同浓度VAN环境下BT-CFS对CD生长情况的影响；co，CD与BT无细胞发酵上清液（BT-CFS）共培养；co+MIC-VAN，CD与BT-CFS在MIC-VAN处理下的共培养；co+MIC/4-VAN，CD与BT-CFS在MIC/4-VAN处理下的共培养；co+MIC/16-VAN，CD与BT-CFS在MIC/16-VAN处理下的共培养；E. 不同浓度VAN环境下CD无细胞发酵上清液（CD-CFS）对BT生长的影响。co，BT与CD-CFS共培养；co+MIC-VAN，BT与CD-CFS在MIC-VAN处理下的共培养；co+MIC/4-VAN，BT与CD-CFS在MIC/4-VAN处理下的共培养；co+MIC/16-VAN，BT与CD-CFS在MIC/16-VAN处理下的共培养。Control, 不含VAN的单菌培养体系和双菌培养体系。mono CD，单独培养的CD；mono BT，单独培养的BT。在Fig 1A, 1B, 1C中使用Tukey's multiple comparisons test分析同一VAN浓度下不同培养体系间显著性差异，在Fig 1D, 1E中使用Tukey's multiple comparisons test分析组间显著性差异，不同小写字母代表差异显著，p<0.05。
图2. VAN环境下CD与BT单独及共培养时的菌体游动性、TcdA毒素产量和毒力基因tcdA、tcdB、spo0A相对表达量。A. VAN环境下CD单独培养及CD与BT-CFS共培养时的菌体游动性；co，CD与BT-CFS共培养；co+MIC-VAN，CD与BT-CFS在MIC-VAN处理下的共培养；co+MIC/4-VAN，CD与BT-CFS在MIC/4-VAN处理下的共培养；co+MIC/16-VAN，CD与BT-CFS在MIC/16-VAN处理下的共培养；B. VAN环境下BT单独培养及BT与CD-CFS共培养时的菌体游动性；co，BT与CD-CFS共培养；co+MIC-VAN，BT与CD-CFS在MIC-VAN处理下的共培养；co+MIC/4-VAN，BT与CD-CFS在MIC/4-VAN处理下的共培养；co+MIC/16-VAN，BT与CD-CFS在MIC/16-VAN处理下的共培养；C. VAN环境下CD单独培养及CD与BT共培养时的TcdA毒素产量；co，CD与BT共培养；Control，不含VAN的CD单独培养及CD与BT共培养体系。D. tcdA基因相对表达量变化；co，CD与BT-CFS共培养；E. tcdB基因相对表达量变化；co，CD与BT-CFS共培养；F. Spo0A基因相对表达量变化；co，CD与BT-CFS共培养。mono CD，单独培养的CD；mono BT，单独培养的BT；在Fig 2A, 2B中使用Tukey's multiple comparisons test分析显著性差异，不同小写字母代表差异显著，p<0.05；在Fig 2C, 2D, 2E, 2F中使用two-way ANOVA followed by Sidak's multiple comparisons test分析显著性差异，ns, p>0.05; *, p<0.05; ****, p<0.0001。
图3. VAN环境下共培养体系对Caco-2细胞活性的影响及CD黏附Caco-2效果评估。A. 不同处理对Caco-2细胞形态的影响；Control，用稀释4倍的BHIS处理的Caco-2细胞形态；mono CD，单独培养的CD对Caco-2细胞形态；mono BT，单独培养的BT对Caco-2细胞形态；co，CD与BT共培养对Caco-2细胞形态；co with VAN，VAN环境下CD与BT共培养对Caco-2细胞形态；B. 不同处理下的Caco-2细胞存活率；Control，用稀释4倍的BHIS处理的Caco-2细胞存活率；mono CD，单独培养的CD对Caco-2细胞存活率；mono BT，单独培养的BT对Caco-2细胞存活率；co，CD与BT共培养对Caco-2细胞存活率；co with VAN，VAN环境下CD与BT共培养对Caco-2细胞存活率；C. 不同处理下CD对Caco-2细胞黏附率评估；mono CD, CD单独培养对Caco-2细胞的粘附率；co，CD与BT共培养时对Caco-2细胞黏附率；co with VAN，VAN环境下CD与BT共培养对Caco-2细胞黏附率。使用Tukey's multiple comparisons test分析显著性差异，不同小写字母代表差异显著，p<0.05。
图4. 不含VAN环境下的单生生物膜和共生生物膜及含有VAN环境下的共生生物膜中CD在模拟肠液中的存活率、生物膜基质蛋白和多糖含量。A. 生物膜中CD在模拟肠液中的存活率。B. 生物膜基质中的蛋白含量。C. 生物膜基质中的多糖含量。注：mono CD，CD单生生物膜；mono BT，BT单生生物膜；co，CD与BT形成的共生生物膜；co with VAN，VAN环境下CD与BT形成的共生生物膜。使用Tukey's multiple comparisons test分析显著性差异，不同小写字母代表差异显著，p<0.05。
图5. VAN环境下CD与BT单独及共培养时的生物膜在激光共聚焦（CLSM）和扫描电镜（SEM）下的成像。A. 激光共聚焦分析单生生物膜及共生生物膜3D图像。标尺：25 μm；B. 单生生物膜及共生生物膜的厚度（μm）；C. 单生生物膜及共生生物膜的SEM图像，标尺：50 μm（上），5 μm（下）。注：mono CD，CD单生生物膜；mono BT，BT单生生物膜；co，CD与BT形成的共生生物膜；co with VAN，VAN环境下CD与BT形成的共生生物膜。使用Tukey's multiple comparisons test分析显著性差异，不同小写字母代表差异显著，p<0.05。
图6. FISH探针标记的共生生物膜中CD与BT分布情况及共生生物膜中CD活菌计数。A. FISH探针标记的共生生物膜中CD与BT分布，Cy3标记的CD为红色荧光，Cy5标记的BT为蓝色荧光，标尺：25 μm；B. CD单生生物膜及共生生物膜中的CD菌落数。mono CD，CD单生生物膜；co，CD与BT形成的共生生物膜；co with VAN，VAN环境下CD与BT形成的共生生物膜。使用Tukey's multiple comparisons test分析显著性差异，不同小写字母代表差异显著，p<0.05。
总结与意义
VAN是治疗CDI的首选抗生素，但伴随着较高的复发比例，这一现象背后的主要原因包括顽固性孢子的形成、耐药菌株的产生、以及肠内生态紊乱所导致的机会主义微生物感染等。在新型抗生素发现速度不断减缓的背景下仍然需要传统抗生素来帮助人体抵御各种微生物感染，这意味着对于传统抗生素进行“二次开发”尤为重要。研究表明肠道菌群结构的变化能够显著影响药物的实际疗效。人为调控肠道菌群结构已被证实在多种疾病治疗中具有可行性，如FMT在IBD、IBS和CDI中的应用。这种微生态疗法的核心在于通过精准调控宿主肠内物种生态结构进而达到期望疗效。VAN治疗CDI的主要作用场所在肠道，我们推测肠内存在的特定微生物可能会影响VAN的实际疗效，最终导致疗效很好或疗效欠佳。因此，通过人为增加或删除肠内特定物种来提高VAN的疗效可能是对传统抗生素进行“二次开发”研究的新方向。然而，开发这种靶向肠道菌群的治疗方法前提是要明确肠内特定物种之间的生态关系。
在前期研究中，我们发现接受了VAN治疗后的部分pCDI小鼠在一段时间后再次出现感染，并伴随着肠道中拟杆菌门，特别是其中的BT相对丰度的显著升高。我们推测VAN环境下CD与BT之间可能存在互作关系。Elahi等发现BT细胞壁相关聚糖能够抑制CD糖基化毒素的产生，从而遏制CDI的发展。同样，Li等发现BT通过改变小鼠菌群结构及胆汁酸水平进而缓解了CDI所引起的损伤与炎症。因此，BT在当前被认为是CDI防治中具有应用潜在的下一代益生菌。然而，我们的研究结果对这一观点提出了挑战，即CD与BT之间的拮抗关系在VAN存在的条件下可能转化为互利共生关系。我们发现在特定浓度VAN存在的情况下，相比CD单独生长所形成的单生生物膜，CD与BT共生所形成的共生生物膜产量大幅度提高，而这些共生生物膜膜内含有更多数量的CD菌体细胞。与此同时，在共生生物膜的庇护下CD菌体表现出对肠液更强的耐受力。
综合来看，VAN环境下CD与BT所形成的共生生物膜产量明显高于单生生物膜。这些共生生物膜中包含有更多数量的CD菌体细胞，能够更好的耐受肠液杀伤。共生生物膜中，CD的毒素蛋白TcdA产量提高、毒力基因tcdA和tcdB表达量上升、菌体游动性增强，此外CD对于Caco-2细胞的粘附力也大幅度提高。BT具备成为下一代益生菌的潜力，但其在CDI治疗中的安全性需要进一步评估。与此同时，靶向删除或削弱宿主肠内的BT含量可能更有利于VAN在CDI治疗中实际功效的发挥。
