（本文由原文第一作者陈晓丽、共同第一作者王淼啸编译）
导读
著名经济学家 Adam Smith 在经典著作《国富论》中指出，分工是提高劳动生产率和增加国民财富的主要途径之一。对于一项复杂的工作，由每一个匠人专一于特定的工序，不同匠人之间分工合作共同完成此项工作，被认为是一种高效的策略。然而，在实际的生产活动中，我们也常常遇到“猪队友”，或者合作个体之间沟通不顺畅的情况，导致合作的效率大大降低。此时我们不禁感叹：“靠队友还不如靠自己”！于是，我们勤加苦练，偷偷学会了队友的技能，把自己变成了一位全能的“超人”，这样就能抛弃队友，独自完成这项工作了！
同理，微生物群落更是这样一个追求高效率的社会。微生物合作是否是一种高效的生产策略，始终是一个颇具争议的问题（其中恩怨可参阅笔者《合作或竞争？微生物互作研究中的“恩怨情仇”》推文）。更有意思地是，对于同一项工作，在不同环境条件下，微生物甚至会采取不同的策略。一个经典的例子为好氧硝化过程（氨生物氧化为硝酸根的过程）：①在扩散高效的环境中，硝化由氨氧化菌和硝化菌的分工合作完成；②而在扩散受限的生物被膜中，合作分工受限，硝化则由全能的全程硝化菌完成。那么，当环境由一个有利于“分工”的条件转变为一个有利于“全能”条件时，微生物群落是否能迅速的作出响应，从“分工”逆向进化回“全能”呢？
2024年8月22日，国际权威杂志PNAS刊发了北京大学吴晓磊教授、聂勇副研究员课题组的最新研究成果《The evolution of autonomy from two cooperative specialists in fluctuating environments》。该研究结合合成代谢分工群落的实验进化和定量数学分析，严谨地回答了上述问题。研究提出了首个实验证据，指出微生物种群间的水平基因转移，可以介导微生物从合作分工逆向进化出全能个体。研究还指出，波动的环境条件可以促进群落中不同分工个体的共存，有利于水平基因转移的发生和全能个体的演化。
图1 论文图片摘要：代谢分工个体可通过水平基因转移逆向演化为功能完整个体。
本研究是吴晓磊教授、聂勇副研究员课题组倾力打造的代谢分工宇宙的第七部作品，是课题组结合模式合成代谢分工群落和定量数学模型分析取得了的最新成果。代谢分工宇宙的前六部作品已在Cell Systems、Cell Reports、ISME J等杂志上发表：
（1）提出了代谢分工群落稳定性和组装的定量规则（Wang et al., Cell Reports, 2022：https://doi.org/10.1016/j.celrep.2022.111410）；
（2）提出了功能冗余影响代谢分工群落代谢效率的定量规则（Wang et al., Cell Systems，2024：https://doi.org/10.1016/j.cels.2023.12.004）
（3）揭示了在具有空间结构的环境中，微生物分工演化形成的条件（Wang et al, ISME J, 2021：https://doi.org/10.1038/s41396-020-00858-x）；
（4）阐明了底物特性调控代谢分工群落构建的定量原则（Wang et al., mLife, 2022：https://doi.org/10.1002/mlf2.12025）；
（5）揭示了代谢分工群落的空间组装规律（Wang et al., Microbiology Spectrum, 2022：https://doi.org/10.1128/spectrum.01944-21）；
（6）揭示了代谢通量调控代谢分工群落构建的定量原则（Chen et al., ACS Synthetic Biology, 2023：https://doi.org/10.1021/acssynbio.3c00022）；
（小编注：可以用“代谢分工”为关键词搜索公众号前期推文，有详细中文解读！）
论文信息
英文标题：The evolution of autonomy from two cooperative specialists in fluctuating environments
中文标题：波动环境中两个合作专一基因型向自主基因型的演化
发表时间：2024.9
DOI：https://doi.org/10.1073/pnas.2317182121
第一作者：陈晓丽，王淼啸
通讯作者：聂勇，吴晓磊
合作作者：罗来鹏，刘晓楠，安丽芸
作者单位：
北京大学工学院；瑞士苏黎世联邦理工学院(ETH Zürich)- 环境系统科学系；瑞士联邦供水、废水处理与水体保护研究所(Eawag)-环境微生物学系；北京大学海洋研究院；北京大学生态研究院；四川大学建筑与环境学院
科学问题
当环境由一个有利于“分工”的条件转变为一个有利用“全能”条件时，微生物群落是否能迅速的作出响应，从“分工”逆向进化回“全能”？
实验设计
本研究在三种不同的碳源环境中进行了代谢分工群落的进化传代实验。三种培养条件分别为：（1）由降解者和解毒者组成的群落在以丙酮酸钠作为唯一碳源的无机盐培养基中培养，每24 h稀释转接，共进行40个生长-稀释循环周期，称为恒定丙酮酸钠环境下的传代实验。在每个周期内，将稳定期的菌液稀释100倍至新鲜培养基中，相当于每个生长周期进行了6.65次分裂，整个传代周期结束后总计268次细胞生长分裂。（2）由降解者和解毒者组成的群落在以萘作为唯一碳源的无机盐培养基中培养48 h，然后将其稀释20倍至以萘为唯一碳源的新鲜培养基中，称为恒定萘环境下的传代实验。转接次数为65次，总计生长了约280代。（3）在传代过程中，降解者和解毒者组成的群落以萘和丙酮酸钠交替作为碳源的的条件下进行传代，称为振荡环境，共转接了41次，总计约275代（图1D）。
在整个进化过程中，为了捕捉潜在随机事件的影响，本研究对每种环境下进行了12个独立的谱系同时并行传代，3种环境共计36个谱系。在多功能酶标仪中通过分光光度法测量600 nm处的菌液浑浊度（OD600）测定菌液的生物量。由于菌液内的降解者和解毒者基因组上含有不同颜色的荧光标记，因此，通过测定降解者和解毒者的红绿荧光强度表征群落组成。
图1 实验设计。（A）能够完全降解萘的自主型菌株的示意图。（B）分工群落进行互利合作的示意图。第一株菌降解者，将萘降解为中间代谢物水杨酸；第二株菌解毒者，进一步将水杨酸代谢为丙酮酸等小分子物质。（C）以萘为唯一碳源时互利共生群落和自主型菌株的生长曲线。（D）进化实验设计示意图。在互利共生的条件下，每个传代周期都有萘的供应，因此群落中的两个菌株在整个进化过程中都处于互利合作的状态。在竞争条件下，每个传代周期都供应丙酮酸钠，因此两种菌株竞争生长。在振荡情况下，传代周期中交替供给萘或丙酮酸钠，因此两个菌株在不同的周期中交替进行互利共生或竞争生长。
实验结果
结果一：不同环境下代谢分工群落采取不同的进化策略
在恒定萘环境下，所有谱系中降解者在群落中均迅速占据了主导地位（图2A）。280代后，通过对降解者和解毒者的特有基因进行PCR，以进一步检测进化群落中的基因型，结果显示，降解者特有基因nahA和nahC在所有谱系中均被检测到。然而，解毒者特有基因nahG和nahTH在所有谱系中均未被检测到，这表明降解者和解毒者之间的合作崩溃，降解者在群落中占据主导。使用萘作为唯一碳源测定进化群落和祖先群落的生长表型，结果显示，所有谱系的进化群落均表现出明显高于祖先群落的生长速率，但所有谱系进化群落的最大细胞密度（ODmax）并没有增加（图2B）。接下来，将所有谱系的进化群落梯度稀释后涂布于LB固体琼脂平板上，并从每个谱系中随机挑取4个单菌落进行基因组重测序分析，结果显示所有谱系的进化分离株的条形码标签与祖先降解者相同，证实了这些进化分离菌株都是从祖先降解者进化而来。
代谢分工群落在丙酮酸钠恒定环境下的群落动态结果显示，在传代的早期阶段（大约前20代），所有谱系中降解者相对丰度均下降，并且这种下降趋势在其中的11个谱系中持续了约100代。然而，100代后降解者的丰度在这11个谱系中逐渐表现出各向异性，在第268代降解者的相对丰度5%到96%均有分布（图2C）。
当群落在振荡环境下进化时，在传代的早期阶段降解者的相对丰度表现为振荡动态。具体来说，降解者在以萘为碳源的循环中显示出较高的相对丰度，但当群落传代到以丙酮酸为碳源的循环时，其相对丰度降低（图2D）。值得注意的是，在振荡环境下，12个谱系中有5个谱系在传代结束时的生物量显著高于其他7个谱系，分别是谱系1、谱系4、谱系6、谱系7、谱系11，并且显著高于祖先群落（图2C）。
图2在三种环境下所有谱系传代过程中群落动态。（A）互利共生、（C）竞争和（D）振荡条件下所有进化谱系的群落组成动态（由降解者的相对丰度表示）。（B）进化群落和祖先群落之间的生长动力学比较。本研究计算了每种条件下进化群落和祖先群落的最大细胞密度（ODmax）和最大生长速率（μmax），虚线表示祖先群落的生长水平。
接下来，本研究将上述振荡环境下进化的5个群落梯度稀释后涂布于LB固体琼脂平板上，并从每个谱系中随机挑取4个单菌落进行生长曲线测定，结果显示所有谱系的进化分离株均能够利用萘单独生长。20个进化分离株菌表现出与祖先自主型菌株相似或更高的生长速率。除谱系4中克隆3，谱系6中克隆1和克隆3，谱系11中克隆1、克隆2和克隆4之外，其他14个进化分离株表现出与祖先自主型菌株相似或更高的ODmax（图3A）。为了探究以萘为碳源时5个谱系的进化分离菌株生长表型提高的背后遗传机制，本研究对所有进化分离菌株进行了全基因组测序。首先检查了编码萘降解基因的两个操纵子的基因组位置，祖先解毒者在第一个操纵子中缺少两个关键基因：nahA和nahC，而祖先降解者在第二个操纵子中缺少nahG和nahTH。基因组测序结果显示，所有进化分离株都进化为重新获得了先前敲除的萘降解关键基因。这些重新获得的基因与祖先自主型菌株的基因序列完全相同，这可能是通过其合作伙伴水平基因转移实现的。值得注意的是，这些重新获得的基因与祖先自主型菌株基因组中基因座一致（图3B-C），这暗示了这些基因是通过同源重组的方式插入到基因组中。
为了排除在振荡环境中检测到的自主型菌株来源于实验室储存的原始自主型菌株污染、而非是由降解者或者解毒者通过水平基因转移得到萘降解途径的缺失基因而形成的，本研究对进化得到的自主型菌株基因组标记的条形码分别与原始自主型菌株、祖先降解者、祖先解毒者基因组标记的条形码进行了比对分析。由于降解者、解毒者和原始自主型菌株均已经进行了特异性的条形码标记，因此通过比对进化群落中的自主型菌株基因组上标记的条形码与实验室中原始自主型菌株的条形码，可以判断进化出的自主型菌株是否受到实验室中原始自主型菌株的污染。比对结果显示，5个谱系中进化出的自主型菌株的条形码与实验室原始自主型菌株条形码均不一致，说明进化产生的自主型菌株并没有受到实验室原始自主型菌株的污染。进一步分析显示，进化产生的自主型菌株中，有3个谱系（谱系1、谱系4、谱系6）的进化分离株中的条形码与祖先降解者的条形码一致，说明是由降解者发生水平基因转移得到萘降解基因nahG和nahTH后形成的自主型菌株；另外2个谱系（谱系7、谱系11）中进化分离株的条形码与祖先解毒者一致，说明这2个谱系的解毒者发生水平基因转移得到萘降解基因nahA和nahC后形成自主型菌株。荧光标记结果显示，来自谱系1、谱系4、谱系6的自主型菌株具有红色荧光，来自谱系7、谱系11的自主型菌株也具有红色荧光，这是符合初始的实验设计（即谱系1-6为标记有红色荧光的降解者和标记有绿色荧光的解毒者共培养；谱系7-12为标记有绿色荧光的降解者和标记有红色荧光的解毒者共培养），进一步证明了传代结束时的谱系没有受到其他菌株的污染。
本研究进一步溯源分析了5个谱系中的自主型菌株是在传代的哪个时期出现并被振荡环境选择留下。选择传代过程中群落生物量显著增加（与祖先群落相比）的时间点及之前的时间点保存的菌液，测定群落中多个单克隆的基因型以检测群落中是否出现自主型菌株。每个谱系挑取24个单克隆，并对萘降解相关的4个基因（nahA、nahC、nahG、nahTH）进行PCR和DNA凝胶电泳，通过条带有无反映进化分离株中该基因的有无，从而确定每个单克隆的基因型。结果显示，谱系1、4、6的自主型菌株在第66至92代之间出现并在培养体系中被选择留下；谱系7、11的自主型菌株在第33代之前就已经出现并在群落中定殖（图3D）。这表明振荡环境下群落内降解者或解毒者发生水平基因转移形成自主型菌株在传代实验的早中期就已发生。
图3 震荡环境下来自5个谱系的群落进化为自主型菌株。（A）进化分离株和祖先自主型菌株之间生长动力学的比较。虚线表示祖先自主型菌株的水平。（B-C）祖先和进化菌株中两个萘操纵子的比较序列分析。（B）第一个操纵子包含负责将萘降解为水杨酸的基因，（C）第二个操纵子编码水杨酸进一步转化为丙酮酸的基因。不匹配由白框显示。（D）振荡环境下群落进化为自主型菌株的时间点测定。
结果二：振荡环境驱动代谢分工群落进化出自主型菌株的机制
基于进化实验的结果：振荡环境驱动自主型菌株的进化，而在恒定萘环境和恒定丙酮酸钠环境下却没有检测到自主型菌株，本节进一步探究了振荡环境下进化出自主型菌株的条件是什么。换句话说，为什么既需要萘环境又需要丙酮酸钠环境才能进化出自主型菌株？本研究提出了振荡环境下进化出自主型菌株的3点解释：（1）振荡环境施加了萘选择压力以实现更高的生产力；（2）振荡环境施加了丙酮酸钠碳源有利于降解者和解毒者两种基因型的共存；（3）振荡环境施加了丙酮酸钠碳源提高了降解者和解毒者的生物量，有利于提高水平基因转移发生的可能性。
首先，实验中观察到，以萘作为唯一碳源时，与降解者和解毒者组成的代谢分工群落相比，自主型菌株表现出更快的生长和更高的生物量（图1C），表明了以萘为碳源时，自主型菌株比代谢分工群落具有更高的生产力。然而，以丙酮酸钠作为唯一碳源时，降解者和解毒者相对于自主型菌株具有更高的适应度，说明自主型菌株在丙酮酸钠环境下没有生长优势。此外，在恒定丙酮酸钠环境下所有谱系的进化群落相对于祖先群落均表现出较低的萘降解能力（图2B），这一结果表明，丙酮酸钠环境本身并不利于自主型的进化。恒定丙酮酸钠环境中无法进化出自主型菌株的原因是由于在丙酮酸钠环境下，自主型菌株并没有生长优势，因此也不会被选择留下来。总之，上述结果表明，萘提供的选择压力对于代谢分工群落进化为自主型菌株至关重要。
其次，实验中观察到，在恒定萘环境传代实验中没有进化出自主型菌株。原因可能是由于在传代过程中，降解者很快将解毒者排除，两种基因型无法长时间共存，因此降解者或解毒者无法从伙伴中获得缺失的基因从而形成自主型菌株。在振荡环境下传代的早期（约25代之前），以萘为碳源的周期中，降解者和解毒者共存水平较低，其中降解者占据主导地位。然而，在振荡环境下以丙酮酸钠为碳源的周期中，本研究观察到降解者丰度降低（图2C）。上述现象的出现归因于在丙酮酸钠为碳源时解毒者比降解者具有更高的适应度，导致解毒者的相对丰度增加以促进其在振荡环境中与降解者的共存。综上所述，振荡环境施加了丙酮酸钠碳源有利于降解者和解毒者两种基因型的共存，并且提高了降解者和解毒者的细胞密度，有利于降解者和解毒者之间通过水平基因转移进化为自主型菌株，这是由于供体菌和受体菌的共存是发生水平基因转移的先决条件。
为了进一步验证降解者和解毒者两种基因型共存是发生水平基因转移的关键因素，本研究设计了以下实验：在萘恒定环境下，从祖先群落出发重新开始共培养稀释传代实验，每次转接传代前补加解毒者（使得解毒者在培养体系中的初始接种浓度为OD600 = 0.05），探究在降解者和解毒者共存的条件下单一萘恒定环境是否能够生成自主型菌株。为了探究生物量对于发生水平基因转移的的重要性。本研究设计了以下实验：在萘恒定环境下，从祖先群落出发重新开始共培养稀释传代实验，增大每次转接的生物量，并且增大解毒者在培养体系中的初始接种浓度为OD600= 0.1，探究提高生物量后是否能够增加进化出自主型菌株的频率。
实验结果显示，从祖先群落出发重新进行共培养实验，每次转接传代前通过手动将新的解毒者重新添加到培养体系中以增加共存，稀释转接4次（即培养22代）后，12个谱系中有3个谱系进化产生自主型菌株（图4A），并且增大接种浓度使得12个谱系中有6个谱系进化产生自主型菌株（图4B）。这两个补加解毒者的实验证实了振荡环境下丙酮酸钠周期中降解者和解毒者更好的共存和更高的生物量对于推动自主型菌株的进化发挥着关键作用。
图4 在恒定萘环境下补加解毒者有利于自主型菌株的进化。22代后，（A）重新添加解毒者使得自主型菌株能够在OD600= 0.05的初始细胞密度下在12个重复中有3个进化出自主型菌株。（B）将群落的初始细胞密度增加到OD600 = 0.1，在12个重复中有6个进化出自主型菌株。
使用数学模型推广实验结论
上述研究结果是基于一个确定代谢途径（萘降解）和确定的环境因子组合。那对于别的代谢分工模式和环境因子，波动环境是否依然可以促进水平基因转移的发生和全能个体的演化呢？显然，选取别的代谢途径重建代谢分工群落并重复上述进化实验需要极大的工作量，但我们可以借助数学模型来探究普适性。思路是：
（1）首先构建一个通用的数学模型（这里使用的是常微分方程组，其中不同组合可以由不同的向量组来描述）来描述不同的群落组合的生长和功能动态。假设模型中涉及到n个会影响结果的参数。
（2）利用实验测定的结果对n个参数赋值，进行仿真模拟，将仿真结果与实验数据进行比较，观察仿真结果是否能准确地复现实验结果。如果能，暗示模型可以精确捕捉这一类体系的特征；若不能，则需要对模型假设及方程进行进一步调整，直至其能与实验体系吻合。在本研究中，我们在前期研究构建的数学模型上进行修正，成功构建了一个能描述逆向进化过程的模型，模型结果成功地复现了实验结果：在100次控制变量的重复模拟中，在波动环境条件下观察到了更多逆向进化的发生（图5）。
图 5 数学模型的代表性模拟成功复现了实验的基本结果
（3）为了模拟别的途径条件的情况，用生成随机参数的方法。根据文献检索，确定每个参数在真实情况中可能的取值范围，以及可能的值分布（比如正态分布），据此可以随机抽取一个参数值。对n个参数都做这样的随机可以获得一个参数集。用这个随机参数集对模型赋值，则模拟结果可代表自然界中某个潜在代谢途径的解构结果。随机完成N次随机参数集生成和模拟，则用数学模型完成了N次大实验。
在本研究中，n=14，N=17501。模拟结果表明，在13%的情形中，逆向进化仅在波动环境下发生（图6A）；而在61%的大部分情形下，逆向进化在波动环境和确定环境中均可发生，但波动环境下发生的概念显著高于确定环境下（图6B）。通过定量数学分析，研究找到了决定在各种条件下，决定逆向进化是否能发生的关键因素（图6C-E）。这些结果表明：波动环境总体上表现出对逆向进化的促进作用，但也受到不同的代谢途径和环境条件的影响。
图6数学模型帮助探究实验结论的普适性
研究结论
本文的研究结果表明，与人类社会一样，微生物群落也会对低效率作出迅速响应——当自然选择有利于全能个体时，分工个体可以通过两种途径逆向演化为全能个体：（1）一个分工个体通过自身演化出缺陷的功能（如恒定的萘环境下）；（2）一个分工个体从自己的同伴处通过水平基因转移获得缺陷的功能基因（如波动环境下）。波动环境主要通过促进分工种群的共存来加强基因交流，从而促进逆向演化。所以，当你在工作中发现合作也不太靠谱时，学学微生物，果断变“超人“吧！
作者简介
共同第一作者:
陈晓丽，杜克大学博士后研究员。主要研究方向包括：微生物群落组装及演化、合成微生物组的理性设计与构建。在PNAS、Cell Systems、ACS Catalysis、ACS Synthetic Biology等期刊上发表多篇学术论文。
王淼啸，瑞士苏黎世联邦理工学院（ETH Zürich）博士后研究员，工作于Martin Ackermann教授和Olga Schubert研究员所领导的课题组。主要研究方向包括：微生物间相互作用机制及其生态学意义，微生物群落组装及演化机制，合成微生物组的理性设计与构建原理。在PNAS, Cell Systems, Cell Reports、ISME Journal等期刊上发表学术论文21篇，其中第一或通讯作者署名9篇。担任mLife杂志海外兼职编辑；iMeta青年编委；ISME Journal、eLife、ISME Communications等杂志审稿人。热爱户外徒步，是瑞士最大的华人户外徒步团体Crazy Hikers Zürich的领队之一。小红书徒步博主@一天成天旅行的科研🐶。
通讯作者：
聂勇，北京大学工学院副研究员。主要从事微生物石油烃代谢途径和调控分子机制、微生物群落构建理论与微生物相互作用机制研究。近年来利用定量生物学、合成生物学等方法研究微生物相互作用对复杂群落时空稳定性与功能的调控机制。曾获得“简浩然环境微生物基金”优秀论文奖、教育部自然科学二等奖、环保部“环境保护科学技术奖”三等奖。主持国家自然科学基金青年基金项目、面上项目3项；参与完成多项国家重点研发计划、“973”、“863”等项目。已在PNAS, Nature Communications, ISME J，Cell Systems、Cell Reports，Energy and Environmental Science，mLife，Environmental Microbiology，Applied Environmental Microbiology，mSystems，Molecular Microbiology等期刊发表论文70余篇，获得授权发明专利8项。
吴晓磊，北京大学工学院教授，博士生导师。国家自然科学基金委员会杰出青年基金获得者。长期从事环境微生物群落结构分析与定向调控，环境微生物资源开发与污染治理与环境修复，污水治理与资源化，微生物采油等理论和技术的研究、开发和应用。已在Nature Communications, PNAS, The ISME Journal, Cell Systems，Cell Reports，Environmental Microbiology, Applied and Environmental Microbiology, Molecular Microbiology等杂志上发表论文近200篇。
