Nature Methods | 基于石墨烯的垂直DNA定向及其在DNA–蛋白质相互作用中的应用！

荧光显微镜作为一种重要的生物成像工具，因其能够在生理相关条件下可视化动态过程而具有重要应用价值，尤其在DNA–蛋白质相互作用的研究中具有独特优势。与传统的结构生物学技术（如X射线晶体学、核磁共振（NMR）谱学、电子显微镜等）相比，荧光显微镜能够实时观察分子运动和动态变化，为理解生命过程提供了更多的可能。然而，现有的荧光共振能量转移（FRET）技术虽然能够揭示分子间的相对距离，但其局限性在于只能测量分子对之间的距离，且在动态系统中存在一定的挑战。特别是在快速的转动和平移过程中，荧光显微镜在获取精准的分子定位时容易受到噪声干扰。

近年来，随着超分辨率显微技术的突破，科学家能够在单分子水平上实现更高精度的成像，尤其是在亚纳米尺度上。然而，大部分超分辨率成像技术依赖于样品的固定或具有特定方向性，这在生物样品中可能导致分子功能和动力学的丧失。为了解决这一问题，如何在生理相关条件下实现分子定位，并在动态状态下进行高精度观察，成为了当前的研究挑战。

近日，来自德国慕尼黑大学Philip Tinnefeld教授课题组的研究人员在DNA和蛋白质相互作用的动态研究中取得了显著进展。该团队设计并制备了基于石墨烯能量转移与垂直核酸（GETvNA）的方法，通过利用双链DNA在石墨烯表面的自发垂直定向，成功实现了DNA构象变化的动态研究。该方法通过探针染料与石墨烯之间的能量转移，能够在亚秒级时间分辨率下，达到亚纳米级的空间分辨率，从而提供了更为精确的分子定位。

利用GETvNA技术，研究团队成功测量了多种DNA弯曲现象，包括由腺嘌呤直链、凸起、脱碱基位点以及DNA修复酶内切核酸酶IV结合引起的DNA弯曲。此外，团队还成功观察了O⁶-烷基鸟嘌呤DNA烷基转移酶在DNA上的转位过程，达到单个碱基对的分辨率，揭示了该酶优先结合腺嘌呤直链的特点。该研究不仅展示了GETvNA在DNA–蛋白质相互作用中的广泛应用潜力，也为动态研究提供了传统结构生物学技术所无法实现的高分辨率。

本文通过一系列先进的表征手段，深入研究了基于石墨烯的垂直DNA定向及其在DNA–蛋白质相互作用中的应用，揭示了DNA弯曲的动态过程以及分子扩散行为。首先，作者采用单分子荧光寿命测量技术，通过荧光与石墨烯的能量转移，成功获得了DNA上染料与石墨烯之间的距离信息，从而揭示了DNA在石墨烯表面的垂直定向。具体而言，采用了GETvNA（Graphene Energy Transfer with Vertical Nucleic Acids）方法，利用荧光寿命的变化，成功测量了DNA构象变化的轴向距离。该方法通过精确控制单分子染料与石墨烯之间的能量转移过程，获得了亚纳米级的空间分辨率，能够解析DNA在不同生物学条件下的动态构象变化。

进一步地，作者通过单分子荧光成像，特别是GETvNA的应用，揭示了DNA在不同生物学状态下的弯曲现象。例如，在含有腺嘌呤直链（A-tracts）和凸起（bulges）结构的DNA分子中，作者观察到其弯曲角度的变化，并且进一步通过GETvNA技术，实时跟踪了DNA的构象变化，提供了细节丰富的动态数据。这些结果不仅验证了传统研究中的弯曲模型，还首次捕捉到了DNA分子在不同弯曲状态下的中间构象，并能够深入分析这些中间状态的生物学意义。

通过对DNA–蛋白质相互作用的表征，作者采用了多种技术，进一步提升了对DNA修复、转录等过程中的分子行为的理解。尤其是通过GETvNA的实时跟踪功能，作者成功观察到了O⁶-烷基鸟嘌呤DNA烷基转移酶（AGT）在DNA上的扩散行为，并精确到达单碱基对级别的分辨率，这一发现打破了传统力学测量的局限，为蛋白质扩散研究提供了新的视角。通过该表征手段，作者不仅能够准确地检测到蛋白质在DNA上的单分子扩散过程，还能够揭示蛋白质与DNA的结合亲和力和定向运动，进一步推动了DNA–蛋白质相互作用机制的研究。

在此基础上，作者通过GETvNA技术，成功实现了DNA弯曲的动态测量和实时跟踪，特别是在解析由DNA修复酶如内切酶IV（Endo IV）引发的DNA构象变化时，揭示了DNA在修复过程中的结构变化。该表征方法还有效地捕捉到了DNA在不同生物学功能过程中的时变构象，为深入理解DNA修复、转录调控等生命过程中DNA的动态行为提供了重要依据。

综合所有表征手段，本文不仅通过荧光寿命成像、单分子定位和动态跟踪技术，深入探讨了DNA分子在石墨烯表面上的垂直定向以及在生物学过程中构象的变化，还通过GETvNA技术，揭示了DNA–蛋白质相互作用的细节，推动了对生物分子动力学的研究。这些表征结果不仅验证了GETvNA技术在研究DNA动力学和结构变化方面的独特优势，也为未来通过该方法进行更广泛的生物学和生物物理研究提供了理论支持和技术保障。

GETvNA提供了一个简单的测量和分析流程，只需要配备荧光寿命成像显微镜（FLIM功能）的单分子荧光显微镜，并能够实现在单分子测量中达到Ångström（埃）级别的定位精度。当从不同区域和样品中收集多个分子的数据显示时，高度分布的宽度扩展到8.5–10.5 Å，导致定位精度降低到接近1 nm。

GETvNA的性能对石墨烯表面的质量非常敏感，因为表面缺陷或双层区域可能会改变荧光染料的猝灭效率。因此，必须遵循一个已建立的高质量石墨烯箔片制备协议。为了验证石墨烯制备协议的成功，可以使用如图1所示的DNA构建体作为内部参考。在大面积石墨烯区域上观察到反映到石墨烯的距离的均匀荧光寿命，证明石墨烯表面质量符合要求。

作者研究了不同生物相关的DNA弯曲情形，如含有腺嘌呤直链（A-tracts）或凸起的DNA，以及由酶引起的DNA弯曲。虽然作者的结果与先前的研究一致，但作者还能够分辨中间状态，并观察到在环境条件下单分子级别的动态行为。

GETvNA专注于7–30 nm距离范围内的构象变化和转位事件，因为所采用的简单一维模型要求双链DNA的长度小于其持久长度（约50 nm），同时GET的灵敏度范围上限为40 nm。尽管存在这一限制，GETvNA在DNA弯曲和追踪方面的精确度和动态范围超过了单分子荧光共振能量转移（smFRET），同时保持了简洁的工作流程。此外，DNA构象的异质性也能方便地获取。此外，由于仅需标记供体染料，GETvNA的结果不受受体光物理特性的影响，因此相比FRET，解释更为简单。值得注意的是，非特异性吸附到石墨烯的染料标记分子会被完全猝灭，减少了背景贡献。尽管作者认可GETvNA的这些优势，但作者也指出，smFRET是一种多功能技术，过去三十年来为突破性发现做出了巨大贡献，而GETvNA仍需生物物理学界进一步开发，才能成为一种成熟的技术。

在追踪应用方面，MINFLUX最近已被用于追踪马达蛋白在微管上的一维扩散，并能够分辨4 nm的亚步进（substeps）。在此研究中，作者展示了GETvNA能够通过观察AGT扩散，在DNA上以Ångström级别的精度追踪蛋白质的运动。作者检测到单个碱基对的位移，这通常需要借助复杂的光学镊子装置进行力学测量。

DNA在石墨烯上的垂直定向这一有趣发现，将能量转移的距离测量与超分辨率显微镜的实空间坐标相结合，为整合三维超分辨率动态结构生物学提供了新的机会，尤其在DNA–蛋白质系统的研究中。

GETvNA在动态研究DNA弯曲方面的独特性能，可以应用于解析DNA修复、转录和核小体形成等过程中涉及的机制，其中DNA的弯曲起着关键作用。此外，该方法还可以用于研究蛋白质寡聚化如何影响DNA上的扩散，并且GETvNA的直接扩展到RNA的应用也是可预见的。此外，结合荧光相关分析，GETvNA还可以用来阐明核酸结合蛋白在促进扩散中的微观扩散常数。GETvNA在单分子层面上的应用之外，还可以用于制备加载识别序列的芯片，进而用于转录因子的检测。此外，作为一种导电材料，石墨烯的使用将为基于石墨烯的场效应晶体管（FET）和电气生物传感技术提供理想的电接触。总体而言，GETvNA具有成为一种广泛应用技术的潜力，为结构生物学及相关二维材料领域开启了激动人心的研究前景。

该工作发表在Nature Methods上

文章链接（点击“阅读原文”）：https://doi.org/10.1038/s41592-024-02498-x