在肿瘤学领域，糖酵解+肿瘤微环境已然成为当下备受瞩目的热门研究方向之一，相关的文献研究层出不穷，这一领域的竞争也愈发激烈。要想在这片红海里杀出重围，发一篇具有高影响力的文章，可不是件容易的事儿。不过，别担心，今天小编为大家推荐一篇来自《Biomarker Research》期刊的优秀文章，它竟然斩获了9+的高分，或许能给你一些灵感与启发。
这篇文章不仅在DLBCL研究方面取得了突破性进展，更是为我们提供了一份多组学分析的详细教程和实用范例。
该文整合了单细胞转录组学、批量转录组学、空间转录组学、免疫组织化学和多重免疫荧光等多组学技术，充分利用了大规模公共数据库资源和临床样本资源，从不同维度对弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）进行了全面剖析，构建了基于糖酵解代谢相关基因和细胞亚群的预后评估体系，深入揭示了DLBCL中高糖酵解活性B细胞和肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）与免疫抑制微环境及患者预后之间的关联。
本文不仅深化了我们对DLBCL生物学机制的理解，也为临床上个体化治疗和预后评估工具的开发提供了重要依据。
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弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）是一种高度侵袭性和异质性的恶性肿瘤，传统的预后评估方法未能充分考虑代谢特征及其对肿瘤微环境的影响，导致对高风险患者的识别不足。代谢重编程是癌症的关键特征，其中有氧糖酵解在DLBCL中促进恶性转化和肿瘤进展，但尚无可靠糖酵解生物标志物预测预后。肿瘤微环境（TME）中，糖酵解代谢可影响免疫细胞组成，促进免疫逃逸和癌症进展。但目前尚缺乏对肿瘤微环境中高糖酵解活性B细胞和TAMs之间相互作用的深入理解，以及这些代谢特性如何影响DLBCL的进展和患者预后。
1、细胞异质性及代谢分析：
利用scRNA-seq分析DLBCL样本，使用scMetabolism算法对细胞内的代谢途径进行评估，发现高糖酵解代谢与肿瘤B细胞的恶性程度存在关联。
2、鉴定TAMs子集：
通过聚类分析，鉴定出一组具有高糖酵解活性的TAMs子集。
3、糖酵解代谢基因筛选：
利用高密度加权基因共表达网络分析（hdWGCNA）和基因集评分，确定参与糖酵解代谢的关键基因。
4、空间转录组分析：
在转录组水平上验证高糖酵解代谢评分和高水平糖酵解TAMs与预后不良及CD8+T细胞浸润减少的相关性。
5、预后价值的验证：
在空间转录组、免疫组化和多标记免疫荧光队列中验证糖酵解标志物和IFN_TAM的预后价值，以及它们在不同治疗应答样本中的表达差异。
1、应用scRNA-seq技术鉴定DLBCL中高度恶性B细胞
通过实验，作者利用UMAP图和谐整合分析对细胞类型进行了区分，并对B细胞进行了深入的拷贝数变异（CNV）分析和功能富集分析。实验结果显示，在和谐整合前，细胞类型间区分不显著，但整合后不同类型的细胞得到了清晰区分，且B细胞展现出最高的CNV得分，特别是在恶性肿瘤B细胞中更为显著。进一步的功能富集分析揭示了B细胞的独特特征，包括E2F靶基因、G2M检查点等通路的显著富集。主成分分析（PCA）聚类揭示了五种不同的恶性肿瘤B细胞亚型，其中B1、B3和B4亚型具有较高的CNV得分，被归类为高恶性B细胞类型，而B0和B2亚型则被归类为低恶性B细胞类型。高恶性B细胞相较于低恶性B细胞显示出更高的CNV得分和更丰富的通路活动。
2、高度恶性的B细胞显示糖酵解代谢活性升高
通过实验，作者对不同细胞类型的代谢活性进行了全面分析，实验结果显示，巨噬细胞和单核细胞在多数代谢途径中展现出主要代谢活性，而B细胞在特定代谢途径如嘌呤代谢、硫胺素代谢等中活性增强。进一步探索发现，有18条代谢途径与拷贝数变异（CNV）得分正相关。聚类分析将代谢途径分为六个类别，其中多数正相关途径归类于同一类别并呈现上升趋势。特别地，糖酵解/糖异生途径在三组B细胞（良性、低恶性、高恶性）中均显著增强，且这一趋势在B0-B4细胞的UMAP图和条形图中得到进一步证实。此外，单核细胞/巨噬细胞的糖酵解/糖异生代谢水平也有所提升。
3、糖酵解代谢基因筛选及IFN_TAMs揭示了与高恶性B细胞和CD8+T细胞之间的细胞间通讯
通过实验，作者对良性B细胞、低度恶性B细胞和高度恶性B细胞进行了差异分析，以及巨噬细胞、单核细胞和树突细胞等免疫细胞的分类与功能研究。实验结果显示，高度恶性B细胞中存在一系列与糖酵解/糖异生相关的标记基因表达水平升高，同时转录因子活性也有所增强，功能分析进一步证实了高度恶性B细胞在有氧糖酵解途径中的富集。此外，通过hdWGCNA分析，作者鉴定出了与CNV评分和糖酵解评分正相关的基因模块，并揭示了从低度恶性B细胞到高度恶性B细胞的分化轨迹。在单核细胞/巨噬细胞中，同样检测到糖酵解/糖异生途径的升高，并将其聚类为五个不同的簇，其中干扰素诱导的TAMs（IFN_TAMs）表现出增强的糖酵解促进因子转录因子活性以及更高的糖酵解/糖异生活性。IFN_TAMs还通过特定的配体受体与CD8+T细胞和滤泡辅助T细胞（TFH）显示出特定的相互作用模式。此外，基于特定途径和配体受体的分析揭示了DLBCL中恶性B细胞亚型与其他细胞类型之间的复杂相互作用。
4、糖酵解标志物、IFN_TAMs和LA_TAMs的预后价值
通过实验，作者对TCGA和GTEx数据集进行了分析，比较了弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）患者与健康对照组中STMN1、ENO1、LDHA、TPI1、CDK1、PKM和PPIA这七种mRNA的表达水平。实验结果显示，DLBCL患者中这七种mRNA的表达水平显著更高。进一步地，在GSE181063数据集中，这七个基因与总生存期（OS）相关，并据此构建了一个基于糖酵解标志物的风险评分模型。高风险评分组的OS显著较差，且低风险评分是OS的独立预测因子。该风险评分模型在预测不同年份OS率方面表现出一致的性能。此外，低风险评分患者的基质评分、免疫评分和ESTIMATE评分更高，而高风险评分组显示出免疫耗竭环境。同时，实验还发现IFN_TAMs和LA_TAMs与OS有关，且IFN_TAMs与PD-L1基因表达呈正相关。当结合GLC评分和IFN_TAM进行风险分层时，可以有效预测OS。
5、DLBCL的空间转录组学全貌
通过空间转录组学实验，作者对10例接受R-CHOP治疗前的DLBCL患者的组织样本进行了深入分析，旨在探究糖酵解生物标志物和IFN_TAM的预后作用，以及它们与糖酵解水平、CD8+T细胞浸润之间的关系。实验结果显示，样本质量控制良好，检测到了大量斑点和基因，且测序饱和度较高。Harmony整合后，不同细胞类型之间的分离更加明显，尤其是B细胞和巨噬细胞显示出较高的nCounts值，表明这些细胞类型在DLBCL中的活跃性。CARD反卷积与手动注释结果一致，各样本中细胞类型分布各异。此外，GCB样本的ITH评分显著高于非GCB样本，B细胞的CNV评分最高，且恶性细胞相比良性细胞具有更高的CNV评分。这些结果还证明了inferCNV与SPATA2结果的一致性，以及手动注释与CARD识别的细胞簇之间的一致性。
6、在空间转录组、免疫组化和多标记免疫荧光队列中验证糖酵解标志物和IFN_TAM的预后价值
通过实验，作者对九种细胞类型（特别是B细胞与非B细胞）进行了功能富集分析，并结合单细胞RNA测序以及scMetabolism计算结果，实验结果显示B细胞在多个关键通路（如E2F靶点、G2M检查点等）中显著富集，并表现出较高的代谢活性，特别是在糖酵解/糖异生和氧化磷酸化方面。此外，B细胞中的糖酵解/糖异生标志基因评分显著高于非B细胞，且与应答（R）样本的状态相关。在评估免疫微环境时，发现应答样本中IFN_TAMs浸润水平及PD-L1表达更高，而活化CD8+T细胞的评分较低。活化CD8+T细胞的评分与糖酵解/糖异生评分呈负相关。在DLBCL FFPE样本中，糖酵解/糖异生蛋白的表达对生存期具有预测价值。同时，IFN_TAMs的强度也与预后相关，且其水平较高的样本中CD8+T细胞浸润程度较低。
本文献通过综合应用多组学分析技术，揭示了DLBCL中高糖酵解活性B细胞和肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）与免疫抑制微环境及患者预后之间的关联，并发现高糖酵解恶性DLBCL组织具有免疫抑制微环境，特别是IFN-TAMs与高度恶性B细胞之间的相互作用。基于此构建的糖酵解评分和IFN_TAMs可作为独立预后因素，为DLBCL的发病机制、预后评估和精准免疫治疗提供了重要依据与潜在靶点。
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