Cell重磅！转录组学发现中性粒抗癌相关状态

今天给各位介绍一篇近期发表在Cell上的文章，该文章通过对不同癌症患者的中性粒细胞进行转录组分析，进而发现中性粒细胞在癌症病人中存在着10种不同的状态，而其中抗原呈递状态竟然与生存率有强烈的相关性！究竟怎么样，我们一起看看吧！

标题：

Neutrophil profiling illuminates anti-tumor antigen-presenting potency

期刊：Cell （中科院1区 IF：64.5）

PMID: 38447573 DOI: 10.1016/j.cell.2024.02.005

图1.图片摘要

一、研究背景

中性粒细胞是对抗病原体最丰富、最有效的防御者，在癌症进展中发挥着相反的功能。它们可以感知多种癌症信号，如炎症和损伤，启动肿瘤微环境(TME)的趋化模块。然而，人类中性粒细胞通常寿命短暂而无法进行谱分析(半衰期:6-8小时)，使得大多数单细胞RNA测序(scRNA-seq)方法无法实现这些细胞的高通量谱分析。尽管这些细胞普遍分布在全身的器官和肿瘤中，但由于其mRNA含量较低(中性粒细胞:0.33 mg;巨噬细胞和单核细胞:2.55 mg / 100万个细胞)，我们对人类中性粒细胞的转录多样性和时空异质性的理解仍然不够深入。因此，鉴于中性粒细胞半衰期短，探索中性粒细胞如何在癌症中采用特定的命运仍然具有挑战性。

在癌症免疫学领域，中性粒细胞通常是抑制还是保护的悖论仍然没有解决。长期以来，人们一直认为肿瘤相关的中性粒细胞具有免疫抑制作用，并会加重患者的预后。然而，这些细胞最近被证明能通过释放活性弹性蛋白酶、一氧化氮合酶、活性氧(ROS)来杀死癌细胞。另外，中性粒细胞还具有抗肿瘤免疫表型，可促进自体T细胞反应或干扰素相关的免疫刺激作用。这些看似矛盾的数据提出了一些关键的问题，但人们对这些问题知之甚少。因此需要系统地解码肿瘤浸润中性粒细胞的细胞多样性，并识别其不同的基因表达模式以及它们的生态位框架。

二、实验结果

1、中性粒细胞更容易渗透到某些类型的癌症中

中性粒细胞浸润实体瘤的程度各不相同，但具体的肿瘤类型和浸润程度仍未达成共识。为了探索浸润模式并选择合适的癌症类型，作者测试了8种常见的免疫定量算法，并分析了31种实体癌症的8,766个样本的癌症基因组图谱(TCGA) (STAR方法)。基于三种算法建立了一个一致的中性粒细胞浸润评分，揭示了中性粒细胞浸润的强组织选择性模式，可分为3个亚型(29.6%高，30.0%异质，40.4%低)。例如，中性粒细胞在肺癌和肾癌中表现出高浸润，在胃肠道癌症中表现出中等浸润，这在另一个泛癌症数据集——临床蛋白质组学肿瘤分析联盟(CPTAC) 19中是一致的。通过比较免疫亚型之间的中性粒细胞水平，观察到炎症或纤维化抑制性TMEs中有优先的中性粒细胞浸润，与先前报道的中性粒细胞浸润模式和功能一致。总之，这强调了中性粒细胞浸润的多样性取决于组织和癌症类型，为后续的中性粒细胞取样策略提供了基础。

图2. 泛癌中性粒细胞图谱的生成

（A）全癌样本的中性粒细胞一致性浸润水平（TCGA数据集），显示中性粒细胞浸润水平（左）、癌症类型（中）和分级一致性得分（右）。

（B）根据免疫亚型的中性粒细胞一致浸润水平（TCGA数据集）。***p<0.001；方差分析检验。

（C） 纳入患者和细胞的数量（绿色，内部数据；灰色，公共数据）。排除健康组织对照。

（D） UMAP图（上图）和中性粒细胞比例（下图）。

（E） 中性粒细胞亚群中的基因表达热图（前50个表达）。

（F） 每个中性粒细胞亚群的富集途径。来自京都基因和基因组百科全书（KEGG）和霍尔马克数据库。

2、癌症的转录特征

为了解码转录特征，作者对中性粒细胞进行了聚类，并注意到癌症和组织类型的高度异质性。我们观察到10种不同的状态，包括S100A12+、HLA-DR+CD74+、VEGFA+SP1+、TXNIP+、CXCL8+IL1B+、CXCR2+、IFIT1+ISG15+、MMP9+、NFKBIZ+HIF1A+和ARG1+中性粒细胞。例如，HLA-DR+CD74+亚群显示出主要组织相容性复合体（MHC）-II分子的高表达和在癌症中的普遍浸润。根据中性粒细胞生物学，还确定了可能代表炎症反应（CXCL8+IL1B+）和特异性趋化性（CXCR2+）特征的簇。通过将中性粒细胞转录组解码为转录程序（STAR方法），一致确认了它们的特征激活模式，如趋化性或炎症。鉴于仅在某些癌症类型中报道了中性粒细胞单细胞图谱，作者计算了5项独立研究中与先前定义的中性粒细胞状态和亚群（STAR方法）的相关性。数据的一些子集与已发表的状态显示出很强的一致性，如IFIT1+ISG15+和hNeutro2。总之，中性粒细胞图谱不仅捕捉到了已知的中性粒细胞核亚群特征，还揭示了潜在的不典型中性粒细胞亚群。

3、分子分化与生存相关性

为了探索中性粒细胞枝的支配原理，作者计算了树形结构，并观察了不同子集的分散树叶(图3A)。根据Ro/e分析(观察到的细胞数量与预期的细胞数量之比)(图3B)， HLA-DR+ CD74+和VEGFA+ SPP1+中性粒细胞是总体上最富癌症的亚群，但显示出癌症类型偏好。HLADR+ CD74 +中性粒细胞在非小细胞肺癌(NSCLC)、膀胱癌(BLCA)和卵巢癌(OV)中富集，而在肾细胞癌(RCC)和口腔鳞状细胞癌(OSCC)中浸润减少。相比之下，VEGFA+ SPP1+中性粒细胞在NSCLC、BLCA和OV中呈稀疏浸润，但在RCC和胃腺癌(STAD)中富集。这些数据通过流式细胞术(n = 24)和多重免疫组织化学(mIHC)部分验证，使用独立的多癌tma队列(n = 68)，包括8种癌症类型，包括乳腺浸润性癌(BRCA)、结肠癌(COAD)、肝内胆管癌(ICC)、肝细胞癌(HCC)、STAD、NSCLC、RCC和胰腺腺癌(PAAD)。

图3. 中性粒细胞的分子特征及存活相关性

接着作者比较不同中性粒细胞亚群的细胞因子谱(图3H)。HLA-DR+CD74+中性粒细胞显示高CCL5，可募集T细胞。IFIT1+ISG15+中性粒细胞与PD-L1 (CD274)的高表达相关，表明其具有免疫抑制作用。只有HLA-DR+ CD74+中性粒细胞特异性富集MHC II类分子，如HLA-DRA和HLA-DRB1(图3I)。然而，几乎所有的中性粒细胞亚群都表达高水平的MHC-I类分子，这与它们在所有有核细胞上的一致表达一致。与此同时，中性粒细胞亚群的免疫表型特征显示出显著的多样性(图3J)，而几乎所有亚群都显示出高度的衰老特征，这支持了肿瘤相关中性粒细胞大多处于成熟状态的观点。相反，作者也发现了几乎所有亚群中普遍存在的细胞周期基因表达以及IFIT1+ISG15+中性粒细胞中干扰素相关基因的富集。鉴于已知的中性粒细胞生物学的昼夜节律特征，进一步比较了一天中不同时间取样的表型特征，观察到白天中性粒细胞的成熟和趋化水平更高。这些数据共同强调了中性粒细胞的亚群特异性分子标志。

4、成熟和代谢状态

长期以来，中性粒细胞一直被认为是成熟的、最终分化的细胞。然而，它们成熟状态的多样性是如何实现的仍然是未知的。为了解决这个问题，作者应用了一种基于向量场的深度学习算法来推断谱系规范和分化的渐进步骤。作者观察到沿着中性粒细胞状态的连续分化，HLA-DR+CD74+中性粒细胞观察到的伪时间值最终；该模式通过其他算法复制，包括monocle3,CytoTRACE，和Slingshot。根据中性粒细胞的肿瘤特异性和假时间对其进行了排序，发现HLA-DR+CD74+中性粒细胞可能保留在末端。为了验证这一发现，使用流式细胞术评估了24名癌症类型患者肿瘤内中性粒细胞中的成熟标志物CD11b和CD1636。结果，HLA-DR+中性粒细胞亚群显示出显著更高的CD11b和CD16表达。随后，使用mIHC在癌症中证实了HLA-DR+中性粒细胞中成熟标记物（CD11b和MPO）表达增强。

图4 HLA-DR+中性粒细胞终末分化并代谢重编程

5、亮氨酸代谢控制抗原呈递机制的表观遗传学

为了系统地检测氨基酸对中性粒细胞的影响，作者设计了一种包括所有20种氨基酸的体外筛选策略，并研究了它们对健康供体循环中性粒细胞中抗原呈递的影响（STAR方法）。亮氨酸上调HLA-DR和共刺激分子如CD80。尽管精氨酸略微上调HLA-DR，但它不会影响共刺激分子。通过使用PCR阵列分析进一步扩展了亮氨酸在抗原呈递过程光谱上的分析。值得注意的是，亮氨酸显著促进MHC-II复合物组装的基因表达，增强抗原加工蛋白酶，并促进抗原装载过程。作者证实，细胞内亮氨酸水平在亮氨酸处理后确实增加，并且这些影响不是由于被其他抗原呈递细胞污染所致。RNAseq分析也证实了亮氨酸对MHC-II的影响，但对MHC-I没有影响。

图5. 亮氨酸通过代谢表观遗传调控启动HLA-DR +中性粒细胞的产生

6、抗原呈递中性粒细胞在空间上与T细胞反应相关并为其提供燃料

由于HLA-DR+中性粒细胞有利于预后，作者欲探究其潜在抗肿瘤作用的机制。首先对匹配的肿瘤样本进行批量RNA-seq，对免疫细胞图谱进行处理，对免疫细胞核比例进行聚类，并观察到模式化的中性粒细胞-T细胞浸润图谱。特别地，HLA-DR+中性粒细胞与广谱抗肿瘤T细胞亚群（即CD4+效应记忆T细胞、CD8+效应记忆T细胞和CD8+中央记忆T细胞）共定位。我们获得了50个空间转录组学数据集，涵盖了9种癌症类型(BRCA, SKCM, CESC, COAD, OV, PRAD, LGG, HCC和RCC) 的178,330个位点，并计算HLA-DR+中性粒细胞与主要免疫谱系之间的相关性(STAR方法)。CD8+T细胞和CD4+T细胞在主要谱系中排名很高。值得注意的是，在肾细胞癌样本（GSM5924400）中，CD8+T细胞显示出与HLA-DR+中性粒细胞的强烈共定位，在OV（10x）和癌症（CRC）（OEP001756）样本中观察到类似的结果。这些观察结果表明，抗原呈递中性粒细胞在空间上与T细胞相连。

图6. HLA-DR+中性粒细胞及相关T细胞反应

7、探索基于中性粒细胞的免疫疗法激发TME

另一个关键问题是HLA-DR+中性粒细胞是否具有增强体内免疫治疗的潜力。为此，首先通过收集来自7种小鼠癌症类型的小鼠scRNA-seq数据来评估小鼠TME中中性粒细胞亚群的保存。在小鼠中观察到类似的亚群，如Cd74+、Spp1+Vegfa+和Isg15+中性粒细胞。鉴于上述亮氨酸的作用，作者在体外用亮氨酸刺激小鼠循环中性粒细胞，并观察到Cd74、Cd80和Cd86的上调。然而，来自缺乏亮氨酸转运蛋白或分解代谢酶（Lat1KO、Bcat2-KO和Dbt-KO）的敲除小鼠的循环中性粒细胞对亮氨酸治疗没有反应，再次支持亮氨酸在MHC-II过程中的作用。

图7. 抗原呈递中性粒细胞与相关体内免疫表型的相关性

四、总结

这篇Cell文章通过对来自17种癌症类型225个样本中的中性粒细胞进行单细胞RNA测序分析，确定了不同的临床相关转录状态。代谢分析强调了亮氨酸活化的抗原呈递中性粒细胞在抗肿瘤过程中的治疗潜力。更多详情还请大家移步原文，仔细品鉴。