仅一滴血，五大免疫分型？！能发48+！
学术
2024-12-17 07:03
北京
最近，肿瘤微环境（TME）的特征描述，包括肿瘤浸润 T 细胞的分析、RNA 表达的功能基因组特征以及不同组织微域中炎症细胞和免疫抑制细胞的分布，提高了免疫检查点（ICB） 反应的阳性预测值。但这些方法无法评估患者的全身免疫状态，而全身免疫状态与肿瘤的发展、预后和治疗反应密切相关。小编为大家带来这篇今年5月发表在Cancer Cell（IF= 50.3）上的文章，研究开发了一种免疫分析平台，利用多参数流式细胞仪来描述健康捐献者和晚期癌症患者外周血中免疫细胞的异质性。通过无监督聚类，确定了五种具有独特细胞类型分布和基因表达谱的免疫类型，并在公开数据库的转录组中分析验证了这些发现。免疫类型特征得分用于将全身免疫与患者对不同癌症治疗的反应联系起来，并对预后和疗效预测进行分析。研究结果表明，一种简单的血液检测可作为一种灵活的工具，根据全身免疫分层将癌症患者分为不同的治疗反应组。Comprehensive peripheral blood immunoprofiling reveals five immunotypes with immunotherapy response characteristics in patients with cancer综合性外周血免疫分型揭示癌症患者具有免疫治疗应答特征的五种免疫分型2. 利用多参数流式细胞仪和外周血批量 RNA-seq 描述免疫状态；3. 确定和验证在不同诊断中保持一致的五种免疫类型；4. 通过简单的血液检测对治疗反应进行分层的潜在临床用途。免疫疗法已成为晚期实体瘤患者治疗计划的重要组成部分，这些治疗计划通常还包括积极的化疗和放疗，这些治疗会影响患者的免疫系统，并可能干扰其对后续治疗方案和联合疗法的应答能力。大多数患者的应答率在很大程度上仍无法预测，而且经常出现严重的免疫相关不良事件。 目前，在对癌症患者进行评估时，全面分析全身免疫力还不是常规做法。此外，对患者免疫系统的分析也没有一致的方法。研究将多参数流式细胞仪与自动高通量细胞仪分析平台相结合，建立了临床免疫分层测定。然后利用该平台评估癌症患者的免疫变异，并确定这种变异与不同癌症治疗/的临床显著反应之间的关联。利用常规流式细胞仪对去除了红细胞（RBC）的外周血样本进行分析，开发出了一种全面的免疫分型检测方法，建立了一套端到端的流程（图 1A）。每个细胞类型特异性面板都由以下主要免疫细胞群的表征良好的细胞表面标记物组合组成：自然杀伤（NK）细胞、树突状细胞、单核细胞、CD4+ T 细胞、CD8+ T 细胞、非常规 T 细胞和 B 细胞（图 1B）。对从外周血中分离出的白细胞（WBC）进行了多色流式细胞术，并利用这些抗体面板对样本中所有 CD45+ 细胞进行了量化。根据标记物的表达谱，共鉴定出 650 种细胞类型和活化状态。研究用训练集中的血液样本对健康捐献者和癌症患者进行了初步比较。这些比较显示，单核细胞以及幼稚、中心记忆和终末分化的 CD4+ 和 CD8+ T 细胞的相对频率存在显著差异（图 1C）。与已发表的报一致，这一初步分析支持进一步探索健康供体和晚期癌症患者免疫特征的差异。 研究队列包括 7 个主要治疗组中 84 种不同诊断的实体瘤（图 2A），全血细胞计数（CBC）显示，健康捐献者和癌症患者的红细胞、血小板、中性粒细胞和淋巴细胞的绝对数量存在显著差异，而单核细胞的绝对数量相似。诊断相似的患者没有形成可区分的群组，接受相似疗法的患者也没有形成可区分的群组。相反，健康捐献者和癌症患者形成了不同的群组，不同年龄组的患者也倾向于聚集在一起，这与健康供体一般比实体瘤患者年轻的情况一致（图 2B）。研究结果表明，无论肿瘤或治疗类型如何，该群组中个体间免疫特征的差异都可以用是否患有癌症来解释。 为了探索导致该队列差异的特征，使用了最大相关性和最小冗余性（MRMR）算法，并进行了逐步留一交叉验证，以确定差异最大的细胞群（图 2C）。在癌症患者中，CX3CR1neg CD8+ TEMRA 和单核细胞的比例明显偏高，而在健康供体中，幼稚 CD4+ 和 CD8+ T 细胞以及幼稚和记忆 B 细胞的比例偏高（图 2C 、D）。虽然一些细胞群在老年和年轻的健康供体中存在差异，但这些差异在健康供体和癌症患者之间要明显得多（图 2C），这表明疾病状态比患者年龄更容易导致该群组的变化。而后，研究选择了 20 种细胞类型，并利用它们的频率在内部队列中基于 TabPFN的分类器模型训练，结果表明它在对健康供体和癌症患者进行分类方面表现良好（图 2E）。研究训练的二元分类器模型优于根据常用临床细胞计数面板训练的模型（图 2F 左）。同样，与 TBNK/CBC 面板相比，该分类器在内部队列验证中表现更好（图 2F 右）。这些结果表明，免疫图谱可用于对具有不同临床特征的患者进行分层，而且特异性很高。 3.将外周血中的免疫细胞组成分为五种不同的免疫类型研究鉴定出了五种免疫类型（G1-G5）：G1 表现出高频率的幼稚 CD4+ T 细胞、幼稚 CD8+ T 细胞和幼稚 B 细胞。G2 显示了更高比例的分化的 CD4+ 中心记忆 T 细胞和过渡记忆 T 细胞，以及 CD39+ 调节性 T 细胞（Tregs）。G3 显示成熟 NK 细胞以及 CD8+ 过渡记忆和 PD-1+ TIGIT+ CD8+ T 细胞的频率增加。G4 富含 NKT 细胞以及 CD4+ 和 CD8+ T 细胞的终末分化效应记忆 CD45RA+ (TEMRA) 和 CD45RA- (TEM)。G5 富含经典单核细胞、HLA-DR low单核细胞和中性粒细胞，淋巴细胞的频率较低（图 3A）。与内部队列UMAP 分析一致，有无癌症诊断和患者年龄在免疫类型中的分布并不均匀（图 3A 和 3B）。免疫型 G4 和 G5中的健康捐献者很少，相反，免疫型 G1 含有最大比例的健康捐献者（图 3A）。内部队列中最常见的诊断包含相似范围的免疫型，这表明癌症类型不是免疫型分布的主要驱动因素（图 3C）。从 RNA-seq 和流式细胞仪得出的细胞群频率是一致的（图 3D），从而证实了流式细胞仪研究结果。利用这些 RNA-seq 数据对内部队列的免疫类型进行了差异基因表达分析。结果显示，G1 和 G2 富集了涉及 TCF、LEF 和 CTNNB1 以及 TCR 和 WNT/beta catenin 介导的转录调控信号。G4 富集在与细胞毒性效应 T 细胞反应相关的基因中，而 G5 则富集在与先天性免疫传感和髓系细胞相关的信号通路基因中（图 3E）。细胞因子和趋化因子信号相关基因的单个转录本在免疫类型中显示出不同的表达模式（图 3F）。总之，即使在单个转录本的水平上，也存在免疫型特异性基因表达模式。3.基于流式细胞仪的免疫分型和RNA-seq 的分析验证为了更好地了解不同免疫类型的适应性反应潜力，使用内部队列的RNA-seq数据评估了T细胞复合物的组成。TCR β-链 CDR3 序列的覆盖率在整个队列中是一致的，反映了每个样本中 T 细胞的总体频率（图 4A顶部）。每个患者的优势克隆占总 CDR3 的 10%以上，在 G4中大量富集（图 4A 底部）。免疫类型之间某些人类白细胞抗原（HLA）的代表性不足或过高可能会解释 TCR 复合物组成的差异。因此，分析了内部队列中 HLA-A、-B 和 -C 的等位基因分布（图 4B）。在该队列中，只有 HLA-B07:02 等位基因患者在 G4中的频率明显低于其他所有组别。这一分析表明，HLA偏倚不太可能导致不同免疫型之间TCR库分布的差异。 G4个体的 TCRβ 克隆指数约为其他免疫型的三倍（图 4C 左）。G1、G2和 G3的 TCRβ 多样性明显高于G4和 G5，且从 G1 到 G3 逐渐降低（图 4C 右）。这些基于免疫类型的 TCR 重排差异表明，它们可能与控制 T 细胞分化和克隆扩增的转录程序有关。为了进一步验证这一点，研究扩大了 GSEA 分析范围，使用注释的基因特征来评估免疫类型，观察到了一般 T 细胞分化特征的富集模式（图 4D 右），与 TCRβ 细胞群多样性的免疫类型分布模式相似。此外，转录因子 TCF-7、LEF1 和 ID3 的单个基因表达水平在G1和 G2中最高（图 4E 上），这些转录因子在幼稚和自我更新的中心记忆 T 细胞中表达显著，并控制 T 细胞记忆的发展，这与 T 细胞分化特征得分一致。G4的 PD-1high CD8+ T 细胞特征（图 4D 左）富集得分最高，与对 TCRβ 的克隆分析以及该免疫型中终末分化 T 细胞的频率是一致的。同样，TBX21、EOMES 和 TOX 编码的转录因子是效应 T 细胞分化和衰竭的关键调节因子，它们在 G4中的表达量最高（图 4E下）。为了研究免疫类型与免疫治疗反应之间的潜在关联，分析了内部队列中正在接受 PD-1抑制剂治疗的 70 位不同诊断的癌症患者。虽然不同免疫类型之间的 PDCD1（PD-1）或 CD274（PD-L1）表达没有差异（图 4F），但 G1、G2和 G4患者与 PD-1 信号转导和对 PD-1 抑制反应相关的基因特征出现了富集（图 4G）。综上所述，这些结果进一步支持了G1-G5 与免疫治疗反应的关联。 研究建立了一个与内部队列相似的队列，发现转录组形成了五个与内部队列惊人相似的细胞类型分布（图 5A）。免疫类型的连续性与内部队列相似，对两个数据集的健康供体进行直接比较显示，免疫类型分布没有显著差异（图 5B）。根据疾病发病机制对每个数据集进行分组，与内部队列的分析结果一致（图 3A），健康供体最常被分配到 G1和 G2免疫类型（图 5C）。与健康者相比，慢性病毒感染和细胞外细菌感染患者更常被归入 G4，G4也是 HIV 患者最常见的免疫型分类。所有疾病组中具有 G5的患者明显较多，尤其是与细菌性败血症等全身性炎症相关的疾病。研究分析表明，除了从内部队列中观察到的结果外，这五种免疫类型还能在不同的外部数据集中识别出来，并通过对RNA-seq 进行细胞解旋而得到独立证实，这进一步证明了框架的有效性和广泛适用性。 6. 开发用于确定癌症治疗应答相关性的免疫类型特征评分法如内部队列的 UMAP 投影图所示（图 5D），这些免疫型代表了一个连续体，而不是它们之间完全分离的不连续组。G1和 G2的患者最常聚集在图中的起始点，并分叉成两个分支，终止于 G4和 G5患者最多的节点。G3主要位于 G1和 G5之间，其次位于 G2和 G4之间（图 5E），这表明它们之间存在潜在的过渡关系。 免疫类型特征得分（ISS）反映了每个患者样本与队列中最理想或最高个体免疫类型得分（0 到 10 分）样本的相似程度。将 ISS 绘制成五个不同的伪时间图，以说明这些分数在整个内部队列中的分布情况（图 5E 右）， ISS得分越高，样本越接近该队列中该免疫型的理想特征。最大免疫类型特征得分（MIS）比较患者血样中的所有五个 ISS 值，然后使用最大的 ISS 值为患者分配免疫类型。使用患者的 MIS 进行的免疫分型与内部队列中基于光谱聚类的初始免疫分型结果显示出很高的一致性（图 5F）。因此，ISSs 的量化和患者 MISs 的确定是评估治疗的动态、系统免疫反应的合适分析工具，即使在具有足够统计能力进行相关评估的小型队列中，也可以单独或以互补的方式应用。化疗对免疫系统的组成有深远影响，研究分析了这些变化是否能反映在一组接受新辅助化疗（NAC）的乳腺癌患者的免疫型特征变化中（图 6A）。与有残留灶（RD）的患者相比，对 NAC 病理完全应答（pCR）的患者更常被归入G5（图 6B）。与 RD 患者相比，pCR 患者的 G5 抑制特征得分明显更高，而 G1 免疫特征得分明显更低（图 6C）。G3和G4的趋势与G5相同，而G2趋向G1，这表明预示化疗有效反应的免疫组成发生了更广泛的变化（图6D）。6.临床队列的免疫分型和治疗反应分析
接下来，研究对治疗后 30 天收集的外周血单核细胞（PBMCs ）进行了高参数 CyTOF 分析（图 6E），虽然未观察到免疫分型与无进展生存期（PFS）之间有明显关联（图 6F 左），但分配到 G3的患者的总生存期（OS）明显长于分配到其他免疫分型的患者（图 6F 右）。然后根据中位生存时间将患者分为短OS和长OS，在长OS患者中，与其他免疫类型的MIS相比，G3的 MIS比例更高（图6G）。这些患者G3 的 ISS 总体水平也明显更高（图 6H 左），使用 G3 的ISS二元分类器能以较高的特异性（图 6I 左）区分该队列中的长 OS 和短 OS 患者。研究按OS对不同的治疗组进行了分析，长OS患者G2的 ISS明显较低（图6H和6I右侧），这表明与反应相关的系统性转移范围更广。总之，这项分析支持了之前在 NAC 治疗的乳腺癌中观察到的结果，即 ISS 在独立队列的治疗后反应监测中具有预后价值。 8. 应用免疫模式特征评估接受一线免疫治疗的 HNSCC 患者的 PBMC 样本研究评估了这一平台分层方面的实用性，选择了两组接受 PD-1治疗的晚期头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）患者。使用durvalumab加二甲双胍治疗的患者与单用durvalumab治疗的患者在应答率上没有统计学差异（图 7A），这表明该试验中的治疗应答主要由durvalumab驱动。对该试验中治疗前后的PBMCs进行了批量RNA-seq处理，并使用Kassandra鉴定了细胞百分比，计算出免疫类型 G1-G5 的特征，然后将患者分为不同的免疫类型组。虽然免疫类型的分布没有因反应而出现明显倾斜，但与非应答者相比，更多的应答者倾向于被分配为 G4（图 7B）。对整个队列的 ISS 进行比较后发现，在治疗时间点，应答者的 G3评分明显更高，G4的ISS 呈上升趋势（图 7C）。 7.根据ISSs建立 HNSCC 队列的 ICB 反应预测因子虽然用 MIS 进行免疫分型在应答者和非应答者之间没有统计学意义上的显著差异（图 7D），但应答者G4 的ISSs 明显更高，应答者G3的 ISS 也更高（图 7E）。这与通过Kassandra测量的多个 CD8+ T 细胞群在应答者中的不同代表性相对应（图 7F）。将 G4特征的阳性预测值与通过 RNA-seq 测量的肿瘤中 PD-L1 表达的结果进行了比较，该队列的 G4特征明显优于组织 PD-L1 表达（图 7G）。 综合免疫分型平台在HNSCC-Nivo队列进行了测试，与HNSCC-Durva队列相似，不同臂中的患者具有相似的应答率（图7H）。应答者最常被归入 G2（图 7I），应答者的 G2评分明显更高，从预后角度区分应答者和非应答者的准确率高达 76%（图 7J）。对治疗前样本的分析显示了类似的G2分配模式，所有分配到G2的患者都对nivolumab有反应（图7K），应答者治疗前的 G2评分明显更高（图 7L）。在这种情况下，G2特征显示出作为nivolumab治疗晚期HNSCC的预后和预测生物标志物的潜在效用。基线 PBMCs 的差异分析进一步证实了这一点，分析显示应答者外周血中有十个显著增加的细胞群，其中九个属于 CD4+ T 细胞系（图 7M）。此外，G2评分对该队列的应答分层的准确性高于多种已确定和公布的生物标志物（图 7N）。9. 免疫分型特征改善了基于治疗类型和HPV感染状态的HNSCC 的反应分层人类乳头状瘤病毒（HPV）是 HNSCC 的主要病原体，患者对 PD-1 和 PD-L1的反应与 HPV 状态相关。将HNSCC-Nivo队列中的患者分为HPV+组和HPV-组后发现，对nivolumab应答的HPV+患者G2特征得分没有显著差异（图8A）。对于抗PD-1治疗的HPV-患者，应答者的G2评分明显更高（图7L、8B）。分析了 HNSCC-Durva 组，虽然没有统计学意义，但HPV+应答患者的G4特征得分高于非应答患者，这一趋势也出现在HPV-患者中（图8D）。另一方面，该队列中HPV-患者的G3特征得分在应答者中明显更高（图8C、D）。综上所述，免疫分型特征G2和G3分别对接受nivolumab和durvalumab治疗的HPV- HNSCC患者具有潜在的预测作用，而免疫分型特征G4则有可能对抗PD-L1治疗的应答者进行分层，而与HPV状态无关。 研究开发了一个基于机器学习的免疫分析平台，通过简单的血液测试来评估癌症患者的免疫系统状态，识别出五种具有独特细胞类型分布和基因表达特征的免疫类型，这些免疫类型能够用于免疫治疗疗效及疾病预后预测，为癌症治疗的个性化提供了潜在的生物标志物，为免疫治疗疗效评估提供新依据。Dyikanov D, Zaitsev A, Vasileva T, Wang I, Sokolov AA, Bolshakov ES et al. Comprehensive peripheral blood immunoprofiling reveals five immunotypes with immunotherapy response characteristics in patients with cancer. Cancer Cell 2024;42:759-79.e12.
生信人
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