爆款：多组学联合深度解析T细胞耗竭

学术 2024-12-19 06:59 北京

大家好，今天分享一篇发表在Front Immunol （7.3/Q1）的文章“ Single-cell RNA-seq reveals T cell exhaustion and immune response landscape in osteosarcoma”。本研究旨在深入探索OS复杂的肿瘤异质性中与T细胞耗竭相关的潜在分子调控靶点和核心调控基因。同时开发了一个基于与T细胞耗竭相关基因的多生物标志物模型，该模型可用于评估肿瘤微环境，预测免疫治疗反应，预测不同OS患者的预后。在今后的临床实践中具有重要的指导作用。

T细胞耗竭对于肿瘤治疗和耐药非常重要，然而目前的分析仅仅局限于差异数据分析，并没有深入到遗传层面去做解读，随着孟德尔随机化的井喷，已有的GWAS数据，QTL数据可以帮助我们建立T细胞耗竭的遗传层面的特征，甚至添加各种修饰组学和loop鉴定，这样深度的解析T细胞耗竭情况，才算是从微观到宏观再到微观形成闭环。

深度挖掘T细胞耗竭

单细胞\m6A\Hi-C\组蛋白\耐药\转移

一、背景

骨肉瘤(Osteosarcoma, OS)是儿童和青少年中最常见的侵袭性骨肿瘤，占所有骨肿瘤病例的大多数。骨肉瘤的传统治疗方法包括手术和严格的多药化疗。然而，OS患者的预后仍然非常严峻，主要原因是诊断延迟和早期远处转移。因此，探索旨在改善OS患者预后的创新及有效的治疗方法至关重要。

免疫疗法在人类恶性肿瘤的治疗中具有重要的前景，最近的许多研究都强调了它在肿瘤治疗中的巨大潜力，临床前试验提供了强有力的支持。免疫检查点抑制剂(ICIs)在OS的免疫治疗中表现出相当大的潜力。他们可以驾驭OS的基因组复杂性，从而提高总体结果。尽管免疫疗法在一些研究中显示出良好的治疗效果，但尚未显著改善患者预后。在OS的临床试验中，对ICIs的反应并不好，试验结果也不令人满意。这可能是由于OS的免疫微环境抑制了T细胞功能。其中CD8+ T细胞是癌症免疫治疗的关键组成部分。活化的CD8+ T细胞成熟为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，是免疫系统抗肿瘤反应的关键组成部分，CTL与各种类型癌症的存活率增加有关，并在免疫监视、靶向和消除癌细胞方面发挥关键作用。实现肿瘤根除的最佳方法可能需要结合促进免疫激活和T细胞启动的治疗，抵消肿瘤微环境中的免疫抑制信号，并维持T细胞在癌组织中的存在。

T细胞耗竭是指T细胞在持续的抗原刺激下失去效应功能，这一现象在慢性感染和恶性肿瘤中常见。T细胞耗竭是一个渐进的、分层的、负调控的过程，影响肿瘤微环境中的T细胞。靶向PD-1和CTLA-4的经典抑制剂主要通过减轻功能耗竭来发挥其抗肿瘤作用。然而，这些抑制剂的确切潜在机制需要进一步研究。生物标志物的最新进展揭示了CD8+ T细胞在复杂的肿瘤异质性中的潜在分子调控靶点。此外，耗竭表达的改变之间存在潜在的相关性。

在骨肉瘤中，T细胞耗竭可能影响免疫治疗的效果。骨肉瘤的免疫微环境中，T细胞耗竭可能与其他免疫细胞如调节性T细胞（Treg）共同作用，影响肿瘤的免疫逃逸和进展。利用单细胞RNA测序技术，研究人员分析了骨肉瘤微环境中的T细胞，并发现了T细胞耗竭的存在。研究表明，CD8+ T细胞亚群中存在不同程度的耗竭现象。基于T细胞耗竭相关基因的预后模型显示出强大的预测能力，低TEX评分组患者显示出更有利的预后和对治疗的更高响应性。T细胞耗竭的研究为骨肉瘤的免疫治疗提供了新的视角，未来的治疗策略可能包括针对T细胞耗竭的靶向治疗以及与其他治疗方法的联合应用。

二、数据获取

从GEO数据库获取单细胞测序数据(GSE162454)以及与OS相关的微阵列数据(GSE16091和GSE21257)。此外，从TARGETs数据库中检索84例不同OS患者样本的数据。

三、结果

1. 单细胞分析探讨OS的细胞亚型

使用Seurat包确定细胞群的最佳数量，导致所有细胞分化成13个不同的簇(图1A)。利用这13个主要集群之间基因的差异表达，结合对所有亚群的细胞特异性细胞标记的校正，对骨肉瘤肿瘤微环境中的每个细胞亚群进行了注释分类。这包括免疫细胞(如骨髓细胞、NK/T细胞和B细胞)和非免疫细胞(如成骨OS细胞、内皮细胞、OCs和CAFs) (图1B、C)。在对免疫细胞的景观和动态进行全面检查后，对所有免疫细胞组进行重新分组和注释 (图1D, E)。NK/T细胞经历了类似的过程，而CD8+ T细胞被专门挑选出来进行后续研究 (图1F-H)。此外，我们观察到CD4在T细胞亚群中的低表达水平 (图1H)。

图1

2. CD8+ T细胞位点分化、细胞群通讯和功能富集分析

拟时序分析揭示了不同簇CD8+ T细胞之间的分化状态以及肿瘤微环境(Tumor Microenvironment, TME)内细胞类型的重排(图2A, B)。深入研究了细胞群之间的通信网络，发现CD8+ T细胞簇1比CD8+ T细胞簇2表现出更活跃的相互作用状态和重量(图2C)。经典的炎症激活途径，如TNF、OSM和IFN-II信号通路，在CD8+ T细胞簇1和髓系细胞中表现出更高的活性。同样，研究了细胞因子家族的信号模式和权重，如IL-1、IL-2、IL-4和IL-6通路，以及包括TGF - β、CCL、CD40、补体和TRAIL在内的信号通路(图2D、E)。综上所述，CD8+ T细胞簇1在大多数炎症和免疫激活途径中表现出比簇2更明显的优势。配体相互作用信号强度的进一步可视化显示，与CD8+ T细胞簇1相比，CD8+ T细胞簇2与其他细胞簇之间的配体相互作用相对减弱(图2F)。此外，我们还对两种CD8+ T细胞亚型进行了基因富集分析，以验证我们的假设。KEGG术语的GSVA结果表明，簇1与细胞因子、JAK-STAT和T细胞受体信号通路密切相关(图2G)。此外，通过评估CD8+ T细胞第一亚组中上调和下调的差异表达基因进行KEGG分析。结果显示，NK细胞、坏死下垂、TNF和NOD信号介导的细胞毒性主要通路呈阳性富集(图2H)。至于氧化石墨烯术语，大量的免疫过程在簇1中表现出显著的富集，包括炎症反应、淋巴细胞迁移、增殖和激活，以及T细胞分化和激活调节(图2I)。此外，簇1中GSEA的标志通路表明，与免疫功能相关的分子和通路被高度激活(图2J)。相比之下，在GO、KEGG和GSEA分析中，簇2在代谢相关途径中表现出更大的富集，缺乏免疫激活(图2H)。最后，比较了两个簇之间共刺激和共抑制分子的总体表达状况(图2K)。将这些发现与我们之前的结果相结合，我们提出了两个亚群之间CD8+ T细胞分化的功能耗竭过程。

图2

3.探索与耗竭表型相关的遗传变化

本研究深入研究了CD8+ T细胞亚群分化轨迹中的核心基因水平变化，发现不同集群之间核心基因存在显著差异(图3A, B)。利用HD-WGCNA算法计算两个CD8+ T细胞亚群的基因表达谱，建立了无标度网络(图3C)。通过分层聚类将基因分离到各自的模块中，并基于拓扑重叠矩阵生成基因相似度热图(图3D-F)。核心基因主要集中在绿松石模块，相关性高达96%(图3G)。进一步分析显示，区域内的基因与区域之间存在很强的相关性(图3H)。

图3

4.机器学习构建TEX-signature

在对T细胞耗竭的生物标志物的初步研究中，确定了668个基因，这些基因在两个队列中都普遍存在(图4A)。在对这些耗竭的核心基因进行单变量分析后，使用LASSO、XGboost、GBM、Boruta、CoxBoost和survival-SVM等六种机器学习算法进行特征选择(图4B)。所有算法的C-index值均超过0.8，说明每个模型的性能都很强(图4C)。随后，选择从机器学习模型中获得的生物标记物的交集来构建精细模型(图4D)。筛选RAD23A、SAC3D1、PSIP1三个靶基因，并通过多因素分析计算其对应系数(图4E)。两个细胞簇之间靶基因的表达也被可视化(图4F)。此外，将TEX-score定义为这三个基因的表达值与相关系数的乘积之和。比较TEX评分高的患者与TEX评分低的患者的预后状况显示，在TARGETs队列和META队列中，TEX评分高的患者表现出较差的临床结局，而TEX评分低的患者表现出较好的结局(图4G, H)。此外，ROC曲线下的面积显示了该模型在TARGETs队列和META队列中1、2、3、5和10年的出色诊断效果和预测能力(图4I, J)。

图4

5.列线图的构建及临床特征亚组分析

构建了一个包含年龄、性别、转移和TEX评分的nomogram临床预测图(图5A)。Nomogram 1年、2年、3年、5年和10年总生存率(OS)的AUC值分别为0.96、0.89、0.82、0.79和0.79，表明模型具有强大且一致的预测能力(图5B)。此外，校准图说明了预测OS和实际OS之间的一致程度(图5C)。为了进一步强调TEX-signature的预测潜力，基于TARGETs和GSE21257数据库中可用的临床特征进行了亚组分析。该signature在这些亚组中表现出准确和稳健的性能。根据Kaplan-Meier生存分析，在按OS类型、性别、年龄或转移情况分层的亚组中，低TEX评分组始终表现出优于高TEX评分组的预后(图5D-L)。

图5

6.与TEX-signature相关的免疫特性

在TARGETs队列和META队列中研究了TEX-signature与免疫细胞浸润以及免疫调节剂之间的关系，以评估TEX-signature对OS的影响。TEX评分高的患者与肿瘤纯度有很强的相关性，而TEX评分低的患者免疫微环境和基质评分更有利(图6A)。此外，发现低TEX评分组与CD8+ T细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、NK T细胞、B细胞、中枢和效应记忆T细胞等免疫细胞呈正相关，所有这些细胞都在利用多种算法(包括ESTIMATE、TIMER、MCP-counter和ssGSEA)进行的积极免疫调节和免疫介导的杀伤中发挥重要作用(图6A)。然而，髓源性抑制细胞(MDSC)在低TEX评分组也更丰富(图6A)。此外，TEX评分与大多数免疫调节剂呈负相关，包括抗原呈递、共刺激、共抑制、受体等。还描述了所有免疫检查点分子的表达状态(图6B、C)。最后，在TARGETs队列和META队列中探讨了几个免疫治疗指标。高水平的GEP、CYT和IFN-γ与低TEX评分显著相关，所有这些都是潜在改善免疫治疗反应的决定因素(图6D-F)。

图6

7.可能与TEX-signature有关的生物学过程

本研究检查了癌症的免疫周期，以阐明整个数据集中免疫过程与TEX -评分之间的关系，在研究中，免疫周期的几个步骤在低TEX -评分组中被激活得更多。它们包括肿瘤抗原呈递，T细胞、CD8+ T细胞、Th1细胞、NK细胞、巨噬细胞、B细胞的募集，免疫细胞浸润肿瘤，以及癌细胞的杀伤(图7A)。收集了各种指标，包括T细胞炎症微环境特征(T-细胞炎症)，这是基于IFN-γ和T细胞相关炎症基因的联合潜力来预测PD-1阻断的反应，以及与肿瘤排斥相关的免疫激活相关的Roh (Roh- is)的免疫学特征，以及Davoli (Davoli- is)的免疫学特征，由细胞毒性CD8+ T细胞，NK细胞标记物的表所有这些分数在低TEX分数组中都非常显著(图7B)。免疫抵抗程序(resF-down, resF-up，和resF)代表了肿瘤微环境中免疫抵抗的效果，高TEX评分组患者表现出更强的免疫抵抗(resF, resF-up)，而低TEX评分组患者表现出较低的免疫抵抗(resF-down)(图7B)。免疫扩展标签(ayer - expis)，由与IFN-γ信号高度相关的基因产生。此外，检查了Kobayashi在TARGETs队列中开发的特征，其中低TEX评分与肿瘤细胞、先天免疫、T细胞、IFN-γ反应、Tregs和MDSCs的高水平识别相关，而增殖水平与TEX评分呈正相关(图7C)。发现与炎症和肿瘤抑制相关的转录因子，如USF1、USF2、RFX5、TP53、ETS1、SPI1、GATA和STAT1在低TEX评分组中高表达。在增殖和免疫中起双向作用的因子，包括NF-κB、STAT5B和STAT6，在低TEX评分组中也高表达。其他主要的潜在肿瘤生长因子，如POU2F2、RUNX1、ERG、REL和JUN，在低TEX评分组中也相对增加。除FOXO1、KLF4和SMAD4外，高表达的转录因子包括E2F家族、MYC、TFDP1、ZEB1、TFAP2C、LEF1、FOSL1、TCF7L2、TWIST1、GLI2和FOXO3，在TEX-score高组中促进OS增殖、转移和耐药(图7D)。

图7

8.TEX-signature的功能富集与代谢

在特定生物学功能和途径的水平上检查了TEX评分亚组之间的异同。生物过程的氧化石墨烯分析主要包括白细胞的阳性反应，如低TEX评分组的免疫迁移、粘附、激活和吞噬。这具体包括CD8+ T细胞、B细胞和骨髓细胞介导的免疫的激活和分化(图8A)。氧化石墨烯分析中鉴定的细胞成分与膜和丝状组织成分有关。分子功能包括IgG结合、免疫球蛋白结合、免疫受体活性和丝氨酸型肽酶活性(图8B)。此外，进行了KEGG分析，显示在低TEX评分组中有显著的富集。我们从视觉上比较了两个亚组中相应通路的富集情况。包括toll样受体、T细胞受体、nod样受体、白细胞跨内皮迁移、Fc-γ受体介导的吞噬、细胞因子-细胞因子受体相互作用、趋化因子信号通路和B细胞受体在内的通路都参与免疫过程，这些通路都与低TEX评分组显著相关(图8C)。此外，GSVA的许多Hallmark信号通路与低TEX评分相关，包括补体、IL6-JAK-STAT3和IL2-STAT5信号通路、炎症反应、IFN-α和IFN-γ反应以及TNF -α - NF - kb信号通路。对于TEX得分高的组，结果与之前得到的结果一致(图8D)。

图8

9.TEX-signature对治疗的预测效果

在多个已发表的治疗数据集中验证了其有效性。在免疫治疗的背景下，疾病控制率(DCR)很好地证明了TEX特征的预测能力。GSE91061队列中TEX评分低的患者与TEX评分高的患者相比，DCR显著提高，ROC曲线证实了TEX评分在预测治疗反应方面的稳健性(图9A)。同样，GSE126044数据集中TEX评分低的患者对免疫治疗的积极反应可能性更高(图9B)。Nanthon数据集中TEX评分较低的患者生存时间延长，更倾向于对免疫治疗有反应(图9C)。Mel-ucla数据集中TEX评分较低的患者表现出较好的DCR(图9D)。至于抗血管生成治疗，GSE79671数据集中TEX评分较低的患者更容易对抗血管生成治疗产生积极反应(图9E)。同样，在GSE61676数据集中，TEX评分较低的患者表现出较长的生存时间，并且更有可能对抗血管生成治疗产生良好的反应(图9F)。此外，验证了TEX-signature对化疗的预测价值。如图所示，TEX评分与主要化疗药物有显著相关性，包括多西他赛-坦那霉素、瑞非尼、索拉非尼、拓扑替康、帕唑帕尼和紫杉醇。TEX评分高的患者似乎更有可能对化疗产生积极反应(图9G、H)。

图9

10.TEX相关基因表达的验证

为了验证TEX相关基因在OS患者中的表达模式，我们对3例患者的肿瘤组织和邻近非肿瘤组织进行了RT-PCR和Western Blot分析。结果显示，与邻近非肿瘤组织相比，OS组织中RAD23A、SAC3D1和PSIP1的表达明显上调(图10A、B)。此外，我们利用免疫荧光技术在OS组织中表征了三种靶基因在CD8 T细胞中的定位表达(图10C)。

图10

四、小结

综上所述，本研究阐明了T细胞耗竭在OS免疫治疗和进展中的作用，基于T细胞耗竭相关基因构建的预后模型有望成为OS患者管理和治疗的潜在预测方法。

T细胞耗竭通常与慢性感染和癌症有关，尤其是在肿瘤免疫治疗领域。

T细胞耗竭的特征包括效应功能丧失、抑制性受体表达增高、代谢方式改变等。逆转T细胞耗竭状态是提高免疫治疗效果的关键，这通常通过阻断抑制性通路，如PD-1/PD-L1、CTLA-4、TIM-3等实现。

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