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华西医院耳鼻咽喉头颈外科
文献精读
Runx1 Controls Auditory Sensory Neuron Diversity in Mice
Runx1控制小鼠听觉感觉神经元的多样性
期刊：DEVELOPMENTAL CELL（IF: 10.7）
单位：哈佛医学院
发表时间：2023年2月16日
摘要：声音刺激在小鼠体内由三种分子和生理上不同的感觉神经元亚型编码，称为Ia, Ib和Ic螺旋神经节神经元(spiral ganglion neurons ，SGN)。本研究发现转录因子Runx1控制着小鼠耳蜗中SGN亚型的组成。Runx1在胚胎发育晚期富集在Ib/Ic前体中。在胚胎时期条件性敲除Runx1后，更多的SGN具有Ia而不是Ib或Ic身份。这种亚型转换中，与神经元功能相关的基因比与连接相关的基因更完整。因此，Ib/Ic位置的突触获得了Ia特性。在Runx1CKO小鼠中，SGN对声音的阈上反应增强，证实了具有Ia样功能特性的神经元的增加。出生后Runx1的缺失也将Ib/Ic SGN重定向为Ia身份，表明SGN身份在出生后是可塑的。总之，这些发现表明，正常听觉刺激编码所必需的不同神经元身份是分层产生的，并在出生后的发育过程中保持可塑性。
研究思路及方法：研究团队首先追踪Runx1的表达模式和SGN亚型相关分子的表达模式是否存在关联，通过单细胞测序技术分析检测在内耳中条件性删除Runx1后带来的SGN亚型变化，包括亚型的分类、混合身份的确定及相关基因表达结果，得出Runx1缺失不仅会带来更多的Ia亚型的SGN，而且这种转化与神经元功能相关的基因更密切的结果。接着，团队在形态上和功能上分别探讨了Runx1缺失带来的改变，其结果与Ia亚型SGN的增加密切相关。最后，团队在出生后的小鼠体内条件性敲除RUNX1，探讨小鼠SNG在出生后的可塑性及Runx1在出生后SNG亚型维护上的重要性。
主要结果
1
Runx1在SGN中的表达动态跟踪SGN亚型身份的出现
作者团队首先通过挖掘既往单细胞测序结果（Shrestha等人（2018年），从中发现Runx1在I型SGN中的Ib和Ic亚型中特异表达，然后通过bhlhe22-Cre/+;Ai14/+ 小鼠和Runx1CreER/+;Ai3/+ 评估小鼠耳蜗整个发育过程中Runx1、Calb2和Lypd1的表达模式，得到Runx1的时空变化表达与分子亚型不同的SGN的出现互相吻合，并且提示Runx1可能影响分子多样性SGN的生成。
2
Runx1缺失对SGN分子特性的影响
利用bhlhe22Cre条件性敲除SGN中的Runx1，通过FACS技术收集年轻成年小鼠（P30-P33）的神经元进行单细胞RNA测序。测序结果显示RUNX1的缺失让SGN亚群的相对比例发生了显著变化，这些变化导致Ia SGN比例增加了90%，Ib和Ic SGN比例分别减少了66%和71%。另一方面，通过测量神经元密度发现神经元的数量并未因为Runx1的缺失发生明显的变化，并且利用Imaris对荧光核糖核酸斑点定量分析确定的细胞特异性基因表达水平进行了K-means聚类和基于支持向量机(SVM)的控制数据分类器对数据进行分析，都得到了相同的结论，即在小鼠的SGN中敲除Runx1造成的Ia亚型增加的原因是由于发育过程中神经元分子身份的异常分配引起的。
3
RUNX1缺失造成SGN基因表达的混合身份和层次可塑性
研究团队发现虽然RUNX1的缺失会使得类似Ia亚型的SGN数量增加，但与对照Ia、Ib和Ic SGN相比，一些Runx1CKOIa SGN似乎没有完全向Ia身份的转换，Ib/Ic基因表达保留在Runx1CKOSGN的子集中，如Ntng1、Lypd1和Grm8。因此，Runx1CKOSGN具有一定混合身份的可能性。接着，团队通过使用Supervised clustering/TP-RF分类方法进一步预测Runx1CKOSGN中的亚型身份，发现了确实有部分被归为Ia型SGN中仍具有交错的基因表达结果，且与生理和突触功能相关的基因表达结果比与粘附性相关的基因表达结果更完整。
4
RUNX1缺失对突触位置和形态的影响
每个内毛细胞（inner hair cell，IHC）的突触总数随着Runx1的缺失略有增加，但是突触表达的位置不受影响。团队利用CtBP2和GluA2染色标记突触前后，结合算法分析突触形态后发现Runx1在被敲除后IHC-SGN的突触前后元素发生变化，其大小梯度差异消失。
5
RUNX1缺失改变SGN亚型的神经反应
团队通过进行听觉脑干反应（ABR）记录来表征动物的SGN功能，发现Runx1CKO小鼠在阈值以上声压水平的P1振幅更大，转化为更陡峭的增长函数时，Runx1CKO与同窝对照相比，坡度增加范围为1.5至2.7倍。这些数据表明Runx1带来的基因分子变化具有功能性的影响，具有Ia同一性的SGN的增多导致具有更多高自发频率（Spontaneous Rate，SR） SGN的耳蜗的ABR反应。
6
出生后Runx1缺失造成SGN身份的变化
团队通过对Runx1CreER/；Ai14/+小鼠在P1-P3给予他莫昔芬，然后在P27-P29收获tdTomato+SGN并通过scRNA-seq分析，仍有SGNs摆脱了Ib/Ic身份而成为Ia SGNs，与scRNA-seq结果一致，在耳蜗的组织切片中进行染色也看到SGN身份的类似变化。因此，SGN的亚型标识在出生后仍然是可塑的，并且需要维护Runx1才能最终巩固亚型的标识。
结论
Runx1是生成Ib/Ic SGN亚型所必需的。
Runx1损失对神经功能相关基因的影响比连接功能更大。
出生后删除Runx1仍能改变SGN身份。
Runx1删除后的Ia SGN的过量导致听觉神经反应增强。
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