往期回顾丨图解WB
第4期. Western blot曝光我们注意什么？
第5期. Western blot蛋白条带位置异常？先别慌！
上一期中我们分享了Western blot蛋白条带不在预计位置的可能原因和解决办法（详见往期回顾）。在排除了蛋白预染marker或者制备的蛋白样品等问题后，可能大部分同学出现蛋白条带位置异常的问题已得到解决。但如果你跑的蛋白可参考的资料较少，抗体说明书上也没有预计的蛋白大小，你该怎么办呢？今天再教给大家两个方法，轻松解决条带位置问题~
01
人源与鼠源蛋白大小不同
抗体说明书上只有预计的区间，亦或者是在Hela细胞中表达在25-35kd，但在你的细胞系（非Hela细胞）始终在25-35kd没有条带，而在40kd附近有两条条带，如下图所示。
你可能会觉得实验失败，但你重复了很多次，在25-35kd区间仍然没有看到你预计的条带。此时你应该要考虑重新看抗体说明书，它的种属反应性，以及在Uniprot搜索该蛋白的人源与鼠源大小是否不同。如下图所示，表达在人的目的蛋白大小为290个氨基酸，预计32kd左右，而该蛋白在小鼠身上的大小为337个氨基酸，预计在36kd左右。
此时的解决方法：确定蛋白样品种属。小鼠样本则定在36kd附近（可能靠近40kd蛋白marker），人源样本则目的蛋白定在32kd附近（可能离35kd蛋白marker亦有一段距离）。
02
巧用过表达
除了检索不同种属的目的蛋白的大小之外，如果还是无法确定目的蛋白大小，其实还有一个相对准确的方法：在你的实验细胞中过表达该蛋白。
通常我们用腺病毒或腺相关病毒转染细胞，想过表达该目的蛋白，通常在构建病毒时候会在目的蛋白上融合上一个标签蛋白（常用的标签蛋白分子量小），所以我们除了孵育目的蛋白，还可以孵育标签蛋白抗体来确定目的蛋白位置，如下图所示。
这样，我们就可以确定我的鼠源细胞目的蛋白在40kd下方（预计36-38kd），而55kd附近的条带为顽强的杂带。
备注：蛋白预染marker以Thermo Scientific PageRuler Prestained Protein Ladder 26616举例。
以上就是本次分享的内容啦，希望大家都能顺利解决目的蛋白条带位置问题，进一步实验发现后续更多有意义的现象。大家对于推送内容有任何问题或建议可以在公众号菜单栏“更多--读者的话”栏目中提出，我们会尽快回复！
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