单细胞思路 | 第1期 必学习的最常规的单细胞思路！
文摘
教育
2024-11-09 21:23
北京
单细胞测序技术的应用正在迅速增长，目前在PubMed上仅2024年一年不到已经发表了7000余篇相关的单细胞转录组研究文章。相信我们的小伙伴们所在的许多团队也在进行相关项目或计划开展此类研究。无论是为了开展自己的实验，还是为了深入理解已有文献，掌握单细胞测序的基本思路和最新进展都显得尤为重要。我们会定期为大家总结单细胞测序领域的相关文献，帮助大家逐步积累单细胞研究思路方面的相关知识！本期主要给大家分享的主要单细胞思路是：通过单细胞测序识别/寻找疾病特异细胞亚群。我们将通过介绍两篇经典的高分文献来分享这个主题。文献一：Circulation Research IF =16.5
Circ Res. 2024 May 24;134(11):1405-1423.
doi: 10.1161/CIRCRESAHA.123.323184动脉粥样硬化主要涉及的细胞类型包括内皮细胞、平滑肌细胞(SMC)和各种CD45+免疫/炎症细胞。单细胞RNA测序研究发现，这些主要细胞类型在动脉粥样硬化进展过程中表现出高度的可塑性,会转化为不同的亚型。下面我们就来看一下文章是如何找到细胞特异亚群的吧：
本篇文章通过人类疾病斑块和对照以及动物模型均单细胞分选后测序，发现疾病特异性亚群后，结合SEARNET 研究识别出重要的基因调控网络（GRNs），并在测序数据、临床样本以及基础细胞动物上验证。我们主要关注的是作者如何识别疾病特异性亚群这一部分。
图片展示来自小鼠的健康主动脉弓（最左图，10周）和Ldlr−/−Apob100/100小鼠的动脉粥样硬化主动脉弓（中图，早期阶段20-30周，以及右图晚期阶段45-60周），随着疾病进展我们可以明显发现巨噬细胞簇、一个独立的内皮细胞簇以及几个新的平滑肌细胞亚型簇的形成。接下来便是重点，在这种系列阶段的研究中，通过拟时序、marker基因展示、富集分析等方法来关注细胞亚群的变化就十分常用：
首先作者通过拟时序分析展示细胞亚群的发展变化关系。拟时序分析显示，基线的mSMC1和mSMC2逐渐演变为mSMC3和mSMC4，随后轨迹分为两条路径，一条通向mSMC5，另一条通向mSMC6和mSMC7（图B）。其次分析不同的亚群相对应的功能特征。mSMC1、2、3主要是收缩相关功能，而mSMC6和mSMC7表现出与炎症和成骨相关的基因标记物的高表达水平，体现平滑肌在表型转化过程中的功能改变（C）；在人的斑块测序数据中，通过展示CNN1（收缩相关基因）和DCN（胶原组装基因）在不同亚群的表达对比（F），也体现出亚群功能的改变。而细胞数量的变化均说明随着疾病严重程度的增加，合成型的平滑肌亚群数目会增加（D、G）。由此说明转化后期的合成型平滑肌在疾病当中的重要作用。
拟时序分析提示mMP1可演变为mMP2、mMP5和mMP6，而mMP3和mMP4则大部分位于这条轨迹之外。再富集分析以及相关基因marker展示发现mMP1-mMP4主要由单核细胞样巨噬细胞组成，而mMP5和mMP6的基因则与M1型促炎性（mMP5）和Trem2高脂质相关表型（mMP6）相符。细胞数量分布也提示疾病严重的细胞多聚集在mMP5和mMP6中。提示这两群细胞在疾病发展中重要性。
之后作者则通过结合SEARNET 研究识别出与疾病特异性亚群相关的重要的基因调控网络（GRNs），并进行下游验证，此处就不赘述啦。
文献二：European heart journal IF =37.6
European heart journal vol. 45,4 (2024): 287-305.
doi:10.1093/eurheartj/ehad534
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本研究对九名接受升主动脉置换手术的患者和五名接受心脏移植的个体的升主动脉进行单细胞RNA测序。通过拟时序分析、功能评分、单细胞调控网络推断与聚类、调控子和相互作用组分析，识别出支配平滑肌细胞表型转变的致病的NF-OXPHOS-AP-1轴，并使用人类升主动脉、原代平滑肌细胞和β-氨基丙腈单富马酸盐诱导的AD模型进行了验证。本研究之中一个很关键的引入点，也是通过测序发现某个疾病特异性的细胞亚群，然后再进一步挖掘里面的分子通路机制。在D图中我们能直观地看到，组间差异UMAP图显示在AD患者中合成平滑肌细胞（synthetic SMCs）是一个新兴簇，其在AD中的比例显著增加，并在E中进行了统计验证，表明合成平滑肌细胞是AD特异性的新亚群。
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随后，通过拟时序Monocle工具构建SMC群体到合成型SMCs的潜在发育轨迹，发现收缩型SMCs与其他三种合成型群体之间存在明显的方向性轨迹流动，表明这些合成群体可能起源于收缩型SMC（E）。最后根据先前定义的基因特征和每个群体中表达最高的基因，定义了收缩和合成的得分，然后使用Pearson相关性分析来评估每个细胞收缩得分和合成得分与Monocle组件之间的关系，发现拟时序分析Component 1与收缩呈负相关，而与合成呈正相关（F）。这样就很好地证明了在拟时序进程中SMC的表型转化。
本期推送旨在针对通过单细胞测序识别/寻找疾病特异细胞亚群做了文献分享，寻找到疾病相关的特异细胞亚群往往是许多文章研究的切入点，相对来说也比较直观可行。- 通过拟时序分析、富集分析、marker基因来确认特异亚群的功能，推断其数量与疾病严重程度的关系。
- 通过对疾病特异亚群的上游（产生的关键分子）、本身以及下游（效应的关键因子）做干预，来证明其重要作用。
- 文章的质量与测序样本来源（是否有人源）、结果显著性与意义以及后续验证的可靠性都有关系。
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[1]https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37992083/[2]https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38639096/请添加下方微信，备注：“R语言与组学_互助交流群” 将拉入群中。
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