四川大学华西医院实验医学科陈飘飘和乳腺疾病中心陈洁团队于2024年6月在 Biosensors and Bioelectronics发表文章“DNAzyme and controllable cholesterol stacking DNA machine integrates dual-target recognition CTCs enable homogeneous liquid biopsy of breast cancer”（点击下方二维码即可阅读原文）。本研究提出一种无酶高灵敏的乳腺癌CTCs检测技术。体系由DNAzyme和催化发卡自组装驱动的胆固醇堆叠DNA纳米机器组成，靶向CTCs表面双蛋白实现CTCs精准检测。临床样本验证结果一致性好，提示其在乳腺癌诊断、疗效和预后监测中的应用前景。
循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）从原发性肿瘤脱落，并在循环系统里扩散。由于CTCs侵入性较强，能够植入远处部位引发癌症转移，被认为是随后转移癌进展的重要原因。CTCs检测的无创和可重复性使其在乳腺癌早期诊断和监测中具有重要意义。然而，由于CTCs在血液中浓度极低且临床样本成分复杂，其检测受到限制。因此，为改进目前CTCs检测方法高成本、低灵敏和仪器依赖的现状，本研究以MUC1和HER2蛋白为标志物，开发抗干扰、简单、低成本的高灵敏新方法，以辅助乳腺癌的诊断和评估。
为了克服单一核酸信号放大方法在提升检测灵敏度方面的局限性，研究团队设计了一种结合多组分DNAzyme（MNAzyme）、胆固醇堆叠DNA机器（chol-HP1和chol-HP3）以及催化发夹自组装（CHA）的多重放大策略（图1）。
首先，通过非免疫的逐步离心预处理，从全血中分离出CTCs。适配体与CTCs上过度表达的MUC1和HER2蛋白特异性结合，释放识别链（P1或P2），触发MNAzyme的裂解反应，产生更多的底物链片段（S1’或S2’），实现第一步信号放大，并接着启动下游的CHA反应。在CHA设计中引入金属离子-核酸错配碱基对，并在helper发卡结构（HP2和HP4）的辅助下，实现第二步无酶扩增。
此外，研究设计了胆固醇堆叠DNA纳米机器，整合多个CHA反应，增强了聚合物结构内的空间位阻，保持发夹结构的稳定性，减少信号泄露。最后，由于靶标触发反应而释放的金属离子，猝灭碲化镉（CdTe）量子点（QDs）和Hg2+特异性碳点（CDs），双荧光信号降低，这种荧光纳米材料的使用进一步放大了反应。通过上述级联扩增，本策略实现了对CTCs的超灵敏检测。
图1 乳腺癌CTCs提取和均相荧光检测示意图
本研究首先通过TEM、EDS等表征技术及凝胶电泳，探索了方法可行性。在最佳实验条件下，通过使用CdTe QDs和CDs作为双荧光信号报告分子，对MUC1、HER2蛋白和SKBR3细胞的分析性能进行了实验（图2），并在42例患者全血样本中进行了验证。
实验结果表明，本方法对SKBR3细胞的检出限达到了3 cells/mL。42例临床样本患者的CTCs定量结果显著高于健康人。检测结果与磁共振成像（MRI）、病理结果以及叶酸受体聚合酶链式反应（FR-PCR）试剂盒检测结果一致性良好（图3）。
图2 MUC1、HER2和SKBR3细胞的检测性能
图3 临床样本分析的流程示意图和结果
专家点评
齐晓伟教授：循环肿瘤细胞（CTCs）早在1869年就已有报道，而对CTCs的研究在2008年开始迅速增长。经过10多年的快速发展，近年来CTCs在肿瘤辅助诊断和监测等方面崭露头角。作为一种液体活检技术，CTCs通过无创采样实现早期诊断和动态监测，可以有效指导临床诊疗。目前，CTCs已被AJCC、NCCN、CSCO等指南纳入，作为新型液体活检标志物，为肿瘤的诊断与预后评估提供了更全面的指导。
四川大学华西医院实验医学科陈飘飘和乳腺疾病中心陈洁团队开发了一种检测策略，以MUC1和HER2蛋白为标志物的新方法，利用多种核酸放大工具和荧光纳米材料，实现了超灵敏检测。在临床应用方面，该体系通过真实样本验证，显示出较好的诊断效能；联合双靶标检测为临床使用提供了更多的疾病信息，对指导乳腺癌诊断、监测、疗效和预后提供了有利支持。研究结果不仅为乳腺癌的早期检测和个性化治疗提供了新的技术手段，也为其他类型癌症的CTCs检测提供了参考，在肿瘤诊断和实时监测领域显示出广阔的应用前景。
齐晓伟，医学博士，陆军军医大学第一附属医院乳腺甲状腺外科副主任、副书记，副主任医师、副教授，博士研究生导师。获重庆市杰出青年、重庆市中青年医学高端人才、陆军军医大学红医名师、西南杰青英才等称号。任中国抗癌协会中西整合乳腺癌专业委员会副主任委员、重庆市医学会乳腺病分会常委、重庆市抗癌协会理事兼乳腺癌专委会常委等。任《中华乳腺病杂志（电子版）》、《中华普外科手术学杂志》、《中国普通外科杂志》及Cancer Innovation等期刊编委。主持国家自然科学基金等课题20项。以第一/通讯作者在JAMA Surg、eClinicalMedicine等期刊发表SCI论文50余篇。获得发明专利8项。
作者心得
本研究结合了核酸工具和荧光纳米材料，改进了单一核酸信号放大方法在提升检测灵敏度方面的不足。我们创新性地将胆固醇堆叠DNA纳米机器引入体系，构建了核酸多聚体结构，通过DNAzyme裂解反应释放核酸链，从而驱动CHA反应原位进行。随后，运用荧光纳米材料迅速与释放的金属离子作用，导致信号变化，实现灵敏检测。研究表明，该方法在检测乳腺癌CTCs方面具有较高的灵敏度和特异性，能够实现3 cells/mL的检测限。
研究在投稿2个多月后收到一审大修意见，5位审稿人对研究工作给予了积极评价，提出了许多建设性意见和建议。作者针对审稿意见进行了细致回复，补充了材料的相关表征和验证实验，并完善全文内容，尤其是对方法核心内容的阐述进行了调整。文章在1个月内修回并顺利接收。本文发表于化学和材料等多学科领域知名期刊Biosensors and Bioelectronics。该刊专注于生物传感器和生物电子学的研究、设计、开发和应用，对论文的创新性、科学性及完整性有较高要求。投稿过程中的严格审查和反馈不仅提升了研究质量，也为我们将来的研究提供了宝贵经验。
通信作者
陈飘飘，分析化学博士，医学博士后，副研究员，硕士生导师，四川大学华西医院实验医学科专职科研，四川大学“医学+制造”中心PI。Research、Exploration和Interdisciplinary Medicine期刊青年编委。聚焦“临床分子诊断和便携式医学检验装备”领域，主持国家自然科学基金等项目7项。在Adv Sci、ACS Nano、Nano Lett、Research、Anal Chem、Food Chem、Biosens Bioelectron等期刊发表SCI论文60余篇（IF>10论文11篇）；受理/授权第一发明人国家发明专利25项。获四川省医学青年科技奖应用研究类一等奖、华西医工十大进展-探索类、第九届华西青年榜样等荣誉。
共同通信作者
陈洁，主任医师，博士生导师，四川大学华西医院乳腺疾病中心主任。美国加州大学洛杉矶分校RevIon/UCLA乳腺中心博士后。任中国抗癌协会肿瘤人工智能专业委员会常委、中国抗癌协会中西整合乳腺癌专委会常委、中国医师协会外科医师分会乳腺外科专家工作组专家委员、中国抗癌协会乳腺癌专业委员会青年专家、中国抗癌协会乳腺专业委员会肿瘤标志专业组委员。任《中国普外基础与临床杂志》编委、《四川医学》青年编委。专注乳腺疾病的早期诊断和手术治疗，擅长乳管镜、钼靶立体定位活检。负责国家自然科学基金（面上）2项；作为第一/通讯作者在J Clin Oncol、Br J Surg 等期刊发表乳腺专业SCI论文20余篇（其中5篇>10分）；申请并获发明专利4项。
第一作者
刘惟静，四川大学华西医院/四川大学华西临床医学院外科学（普外）学术型硕士研究生。以第一作者/共同第一作者发表SCI论文4篇。现主要研究方向为乳腺疾病诊治及乳腺癌液体活检。
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编辑：董 敏
排版：张洪雪
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