首次报道了使用计算流体动力学（CFD）模拟和实验方法选择具有优化几何形状和操作条件的工业离心机，以有效地将白喉细菌细胞碎片从培养基中分离出来，特别是收获纯化的细菌毒素。首先模拟了两种不同尺寸的工业规模管式和盘式堆叠离心机，以量化其复杂的流体动力学。为了有效分离细菌细胞，需要在转速、进料流速和可能的细胞损伤之间达到最佳平衡。还发现，大型管式和盘式堆叠离心机的性能明显优于小型离心机。最终，根据CFD模拟结果，在四台离心机中，转速高于5500rpm、进料流量低于100L/h的大型盘式堆叠离心机是在实际过程中使用的潜在候选者。通过使用工业盘式堆叠离心机进行实验，发现CFD和实验数据在细胞分离所需的最佳转速和进料流量方面具有良好的一致性。拉蒙絮凝试验证实了这种生物分离过程的主要产品“从细菌细胞碎片中纯化的细菌毒素”的保存质量和数量。
当涉及到类毒素疫苗的生产时，例如白喉疫苗，从培养液中收获和纯化细菌毒素将是关键目标。下游纯化过程涉及多种技术，以捕获目标生物分子并去除宿主细胞相关杂质（如细胞碎片和其他生物分子）和工艺相关杂质（例如缓冲液、培养液和消泡剂）。在下游单元操作（如微滤、超滤、色谱和渗滤）之前，需要进行固液分离，使流中无细胞。在各种单元操作中，连续流离心机得到了广泛的应用，这很可能是由于它们在操作过程中的坚固性，以及处理大量和含固体流的能力。生产率、纯度、回收率是开发该下游工艺时必须考虑的一些关键参数。这些因素通常通过以非常高的转速和高的体积流量运行离心机来优化。然而，如果进料流速过高，细胞可能会从离心机中逃逸。此外，高流速和转速导致的高剪切条件会导致细胞受损和/或裂解，进而导致杂质负载增加，从而导致繁琐的纯化过程。此外，在工业规模上，在不知道离心机是否能完美工作的情况下购买离心机是不合乎逻辑和经济的。因此，了解离心机的操作及其流体力学对于提供具有最佳条件的适当离心系统是必要的。
使用实验技术对离心机内部的流动、质量和剪切场进行调查是极其耗时、成本高昂的，甚至是不可能的。因此，建议采用CFD模拟等快速、低成本的流体动力学建模方法。使用CFD代码对流体流动现象进行详细可视化，对于解决在系统中放置探头以测量关键参数的困难也大有裨益。这一领域的研究很少。它们包括固体碗离心机中流动的数值模拟、管式碗离心机中颗粒的保留以及使用盘式堆叠离心机进行哺乳动物细胞分离。
工业规模离心机的几何细节和3D模型如图1a-d所示。进行了四种不同单元数量的网格划分方案，以确认模拟结果与网格数量的独立性。表2报告了在管式离心机转速为10000 rpm和圆盘堆叠离心机转速为5500 rpm、恒定流速为100 L/h的条件下，固相（细菌细胞碎片）的平均质量分数和速度的结果。结果表明，通过使用TC1的300和350×10^3单元、TC2的100和150×10^3单元，DSC1的250和300×10^3单元以及DSC2的100和150m×10^3单元的网格方案，可以得出速度和质量分数几乎稳定的结果（表2）。换句话说，通过为每个系统使用这些单元数，预测的流体动力学参数将独立于网格方案。此外，Roache开发的方法被应用于显示网格方案结果的独立性。因此，根据方程式（16）计算网格收敛指数（GCI）。GCI12和GCI23值的结果如表2所示。可以看出，对于为实现稳定解而视觉上批准的网格方案，也获得了非常低的GCI值。
由于大规模模型的计算时间和成本可能是限制因素，在批准的单元数量中，选择300×10^3、100×10^3、250×10^3和100×10^3单元的网格方案分别适用于TC1、TC2、DSC1和DSC2。例如，TC1和DSC1的网格划分方案如图1e、f所示。
管式和盘式叠层离心机的流体动力学环境
图2显示了在100 L/h的恒定进料流速下，两台管式离心机的转速为10000 rpm，两台叠盘式离心机的转速均为5500 rpm时，一次相速度、湍流应力和二次相（细菌细胞）质量分数的等值线图。对于所有离心机，速度朝向离心机碗壁逐渐增加，TC1、TC2、DSC1和DSC2的最大值分别为145、143、108和109 m/s。这些结果表明，旋转碗导致流体的切向速度沿径向增加，这与文献一致。此外，对于叠盘离心机，锥形盘边缘（绿色区域）附近的流体速度梯度高于远离盘区域的流体。
根据文献，这可能完全是由于流体循环造成的；通过通道的流体进入上部通道，在那里离心力再次将其推向边缘。从图2e-h中还可以看出，与中心区域相比，所有离心机壁上的湍流应力都要高得多。对于圆盘叠层离心机，从圆盘边缘到碗壁的区域湍流应力非常高。TC1、TC2、DSC1和DSC2的最大湍流应力值分别为11050、10960、4980和4700 Pa。正如预期的那样，速度和剪应力值几乎与系统尺寸无关。换言之，两种管式离心机的流体动力学与盘式堆叠离心机的流体力学相似。
系统中细胞分布的结果表明，所有离心机壁附近的区域都经历了细胞的高度积聚（图2i-1），表明离心力将细胞推向碗壁。此外，澄清的液体朝向旋转轴移动并从出口离开。在本节研究的条件下，TC1、TC2、DSC1和DSC2碗边缘的最大细胞质量分数分别为0.281、0.21、0.372和0.30。此外，TC1、TC2、DSC1和DSC2出口处的平均细胞质量分数分别为0.050、0.074、0.023和0.051。通过比较两种不同尺寸的离心机的性能，可以观察到，与较小的离心机相比，较大的离心机可以更好地分离细胞。
离心机操作参数对细菌细胞分离的影响
为了了解转速和进料流量对分离效率的影响，图3和图4绘制了碗边缘细菌细胞的最大质量分数值和吞吐量的平均质量分数值。在所有离心机的所有进料流速下，很明显，随着离心机中累积的细胞质量分数值的增加和吞吐量的降低，转速的增加会改善固相的分离。这可能是因为离心机内细胞的径向位置是离心场的函数，而离心场基本上是转速的函数。
对于管式离心机，结果还表明，增加进料流速会导致细胞分离减少（图3）。根据文献，颗粒停留时间随着流速的增加而减少，因此没有足够的时间来实现颗粒停留和沉淀之间的平衡。换句话说，在非常高的进料流速下，与径向方向相比，细胞优先沿轴向方向移动。随着TC2的应用，这种情况越来越严重。
在这些操作条件中，TC1和TC2的转速为15000rpm，进料流量为50和30L/h可能分别导致相对较好的细胞分离。与进料中的细胞质量分数（0.1）相比，这些条件分别导致TC1和TC2碗边缘的细胞质量百分比发生约390%和300%的变化。值得注意的是，在TC1和TC2的任何条件下，出口流中细胞的存在都不能降至零。相比之下，使用DSC1，发现分离效率随着进料流量的增加而几乎保持不变，与管式离心机性能相比，进料流量增加对DSC2的负面影响并不显著（图4）。与文献一致，尽管预计在高进料流速下，颗粒会沿轴向移动，但盘式堆叠离心机中的圆盘限制了这种影响。
因此，圆盘堆叠离心机的最佳条件是DSC1和DSC2的转速分别为7000，进料流量分别为100和30 L/h，可以实现更好的细胞分离。考虑到进料中的初始细胞（0.1），研究表明，这些最佳条件导致两台盘式堆叠离心机碗边缘的细胞质量分数变化高达440%。此外，出口处的细胞质量分数降至零，这相当表明细胞完全缺失。总体而言，由于沉淀细胞的质量分数和吞吐量中的细胞质量分数，本案例研究中离心机的性能遵循DSC1≥DSC2>TC1>TC2的趋势。
预测可能的细胞裂解
由于离心机内部的湍流应力，形成不同大小的涡流可能是细胞损伤的主要原因。因此，首先研究了TC1和DSC1在不同条件下由湍流动能（方程式（14））产生的湍流应力分布（图5）。
从该图可以看出，两台离心机中的诱导湍流应力随着转速的增加而增加。研究还表明，与较高的进料流量相比，较低的进料流速下的湍流应力值更高。这可以归因于较低的进料流速会增加进料停留时间。与TC1相比，DSC1中流量对湍流应力的影响可以忽略不计。
为了精确研究湍流应力对细胞的影响，根据进料中涡流尺寸（de，方程式（15））与平均细胞尺寸（dc，7μm）的比值（de/dc）研究了离心机内的流体动力学环境（图6）。对于TC1，在所有转速下，de/dc比都小于1。此外，该比率随着转速的增加而降低，更可能是由于湍流能量耗散率的增加（图5a）。根据文献，湍流能量耗散率是指吸收的湍流动能导致大涡分解为小涡的速率。当涡流的大小等于或小于细胞的大小时，细胞壁上会产生更高的机械力，这反过来又会增加细胞损伤和/或裂解的可能性。此外，对于TC1，进料流速的降低会导致形成比细胞尺寸小得多的涡流（图6a）。低进料流速不仅导致湍流应力显著增强（图5a），还增加了进料停留时间，使细胞暴露在湍流应力下的时间更长。换句话说，在较低的入口流速下，细胞损伤/裂解可能会发生。因此，似乎使用TC1不可能在导致有效细胞分离和低细胞损伤的条件之间取得平衡。如前所述（图3），转速为15000 rpm，入口流量为50 L/h与其他操作条件相比，可以导致相对有效的细胞分离。然而，这种情况可能会导致高细胞损伤/裂解（图6a）。
图6b显示了不同操作条件下盘式堆叠离心机的de/dc值结果。观察到流速对涡流尺寸的影响并不显著，因为如图5b所示，流速对湍流应力的影响不显著。转速的增加导致de/dc比的降低，这可能是由于湍流应力的增强。在4000 rpm的转速下，de/dc值高于1，因此细胞损伤和/或裂解的可能性很低，因为细胞只是由大涡流运输。之前也有报道称，盘式堆叠离心机在分离哺乳动物细胞方面具有这种性能。虽然从这个角度来看，4000的转速可能是优选的，但在这种情况下，细胞的完全分离是不可能的（见图4）。因此，考虑到转速为5500和/或7000 rpm时的de/dc值不远低于1（分别为0.91和0.84），建议DSC1采用这种条件。这些条件也导致了细胞碎片的相对良好的分离（图4）。
盘式叠层离心机分离细菌细胞的实验结果
为了验证模拟结果，使用与DSC1结构相似的圆盘堆叠离心机进行了一些实验。细菌细胞分离是通过DSC1进行的，在各种操作条件下获得的纯化液的浊度进行了分析，如图7a所示。值得注意的是，在加入离心机之前，细菌培养液的OD为1.06。从图7a可以看出，在恒定进料流量下，OD随着转速的增加而降低，这相当表明转速的增加提高了细胞分离效率。因此，无论进料流速如何，7000rpm都是细胞分离的最佳转速。此外，与转速无关，OD随着进料流量的增加而增加。例如，在7000rpm的转速下，对于50、75和100L/h的进料流速，OD约为0.01，而随着进料流速的进一步提高，OD也会增加，即对于150和200L/h的进给流速，OD分别为0.07和0.12。也许，在高进料流速下，颗粒沿轴向移动，其停留时间缩短，导致沉降速率降低。为了比较实验和模拟的结果，计算了相应纯化液体样品中细菌细胞的质量分数，并将其与模拟结果进行了比较（图7b）。值得注意的是，由于模拟是针对三种流速（50、100和200L/h）进行的，因此对这些流速的结果进行了比较。观察到结果与CFD模拟结果相对一致。模拟和实验都表明，7000rpm的转速以及50和100L/h的流速可以是高效分离细菌细胞的合适离心条件。
从细胞中纯化的毒素（用于疫苗生产的产品），离心通量中细菌毒素的质量和数量（即Lf和Kf）在表3中进行了分析和总结。根据这些结果，在4000 rpm转速下获得的样品的Lf和Kf值与进料的Lf/mL为110±5，Kf为8.0±0.2 min几乎相似。它公平地揭示了在4000rpm下毒素分子的含量和质量的保持，这在统计上也与进料流速无关。然而，随着转速的增加，在50-100L/h的进料流量下，与进料相比，观察到较低的Lf值和较长的Kf值。这一结果可能是由于转速的增加导致湍流应力的增强。此外，在低流速下，进料停留时间增加，因此细胞暴露在湍流应力下的时间更长。从CFD模拟结果（图6b）可以看出，de/dc比随着转速的增加而降低。因此，在这种条件下（在5500和700 rpm以及50-100 L/h的进料流速下），生物分子壁上会产生更高的机械力，这反过来会导致生物分子损伤（即本研究中的细菌毒素）和毒素质量和数量的减少（表3）。
相比之下，对于150和200 L/h的进料流量，转速对毒素质量和数量的影响在统计学上并不显著（表3）。也许，在高进料流速下，进料停留时间较短，因此湍流应力对涡流大小和生物分子的负面影响较小。然而，如前所述（图4），高流速和低转速会导致细胞碎片分离不足。因此，必须选择最佳条件，以满足细菌细胞的有效分离和细菌毒素的保存。建议盘式堆叠离心机以5500 rpm的转速运行，进料流量为100 L/h，这也可以实现相对良好的细菌细胞分离（OD为0.09和/或细菌质量分数为0.03）以及理想的保存毒素质量（Lf/mL为100±3，Kf为8.3±0.1 min）。
一种用于分离细菌细胞碎片和收获纯化的细菌毒素。通过对工业规模的管式和盘式堆叠离心机进行建模，观察到每种离心机类型内的速度场和湍流应力场具有可比性。然而，细胞分离能力取决于系统尺寸，其中较大的系统比较小的系统提供更好的性能。对于管式离心机，细胞分离需要高转速（15000rpm）和低进料流速（即TC1和TC2的50和30L/h），尽管完全的细胞分离尚不可能。总体而言，CFD技术用于了解离心机的流体动力学环境，并选择操作优化的离心机。此外，管式离心机中细胞损伤和/或裂解的可能性很高。相比之下，使用盘式堆叠离心机很容易在分离效率和细胞质量之间保持平衡。实验进一步验证了DSC1的CFD模拟结果，并选择了最佳操作条件，包括转速为5500 rpm和进料流量为100 L/h。该过程实现了良好的细菌细胞分离（纯化液中OD为0.09，细胞质量分数为0.03），以及纯化细菌毒素的良好质量（Lf/mL为100±3，Kf为8.3±0.1 min）。本研究深入探讨了CFD方法的应用，以轻松理解离心机的复杂流体动力学环境，高效的工艺优化，最重要的是在生物工艺中实施设计质量。
