细胞培养液的澄清是生物制品纯化的第一步。去除细胞和细胞碎片等固体颗粒，并通过0.2 μm过滤器处理所得材料，为初级亲和层析步骤做准备。通常，澄清涉及两级深层过滤或离心，然后进行一级深层过滤。有报告称，尽管两级纤维素深层过滤器是一种成熟的澄清技术，但相关的成本和空间限制限制了深层过滤处理的料液体积（约4000升。对于更大的容量，生物制造商更喜欢使用盘式堆叠离心机（DSC）进行第一步澄清。
通过保持离心机进料流速（Q）与重力等效设定面积（∑）的恒定比率，可以扩大DSC过程的规模。后一个变量表示特定操作条件和设备设计下颗粒在重力作用下沉降所需的面积。因此，Q/∑比可作为离心机颗粒沉降能力的替代指标。该比率的应用假设受到离心力的固体颗粒具有抗剪切性，并且在离心过程中保持完整。然而，哺乳动物细胞对剪切敏感，破坏它们会释放细胞内成分，如宿主细胞DNA（hcDNA）、蛋白质（HCP）和蛋白酶，这些成分会增加澄清收获材料中的杂质含量，降低所得产品中的治疗性蛋白水平。
随着公司将生物制剂生产从一次性设备的小规模工艺过渡到大规模制造，工艺工程师必须考虑DSC剪切的影响。此类设备的操作条件应根据平衡颗粒沉降能力（Q/∑）和剪切力的设计空间进行选择。尽管现有文献对Q/∑比进行了广泛的讨论，但它没有提供直接的放大方法来评估圆盘堆叠离心过程中产生的剪切力。在此，我们讨论了DSC中剪切评估的三种方法，这些方法是离心机设计和操作参数的函数：涡流长度、尖端速度和功耗模型。此外，我们还说明了DSC的操作设计空间，显示了颗粒沉降能力和剪切力之间的平衡。
Figure 1: Fluid and particle flow between the discs
方法1：
颗粒涡流长度流体流速（ϑL）：颗粒长度模型假设圆盘间距之间的流体流动是层流的，流动在所有可用的圆盘空间中均匀分配，并且沉降的颗粒不会返回圆盘之间的环形空间。考虑到这些假设，方程式1计算了流过圆盘之间环形空间的流体速度（图1a）。这里，Q表示离心机进料流速，单位为m3/s，nds表示盘间距的数量，Aavg是盘间距之间流体流动的平均横截面积。Ro和Ri是离心机锥形盘的外半径和内半径，h是盘之间的距离或间距。
静态流体条件下离心力下的颗粒速度（pcf）：当离心碗旋转时，离心力使颗粒从中心轴向外加速。方程式2给出了静态液体中粒子的离心速度。其中，ρL和μL分别表示流体的动态密度和动态粘度；ρL=1015kg/m^3和μL=1.05×10^-3 P.s是收获时典型细胞培养液的良好近似值。变量dp表示粒径。
Maschke等人报告称，中国仓鼠卵巢（CHO）细胞大小遵循高斯正态分布，范围为10-20μm，预期平均大小为~14.45μm。因此，对于细胞培养收获的应用，dp通常被假设为14.5μm。然而，在DSC应用中，建议将更严格的20μm值用于细胞再循环到以灌注模式运行的生物反应器，因为大多数类型的（活的）哺乳动物细胞的直径可达20μm。N是离心机转鼓速度，单位为每分钟转数（RPM），ω是角速度（单位为1/s），R是旋转半径。对于剪切评估，R被假设为Ro，这是一种保守的方法。
阻力（Fd）：阻力是指粒子在流体中抵抗运动的摩擦力。在离心过程中，散装流体的流动方向与颗粒的沉降方向相反，在沉降过程中，由于流体和颗粒之间的相对运动，颗粒会受到阻力。阻力的作用方向与粒子的运动方向相反（与流体流动方向相同）。因此，相对颗粒速度，也称为滑移速度（θp），等于静态液体的颗粒离心沉降速度（θpcf）与圆盘空间之间的流体速度（θf）之差（图1b）。作用在颗粒上的阻力和离心力之间的平衡使这些颗粒能够达到恒定的θp速度。
基于斯托克斯定律，方程3给出了作用在沿相反方向流动的流体中的运动粒子上的阻力。该公式基于四个假设：当颗粒通过离心机时，它们保持球形，不会聚集或破裂。悬浮液中的颗粒浓度足够低，可以防止沉降障碍。离心颗粒在径向方向上移动，在过程中的任何时候都不会切向移动。颗粒沉降速度在层流（斯托克斯）区域下降；因此，在整个过程中，雷诺数（Re）应小于0.4。
阻力系数（Cd）：对于斯托克斯流态中的球形颗粒，Cd是Re值的函数，如方程3所示。
雷诺数是一个无量纲的量，计算为流体流中惯性力与粘性力的比值，假设惯性力导致流动，粘性力抵抗流动。因此，Re值低的流动被表征为层流和平滑，而Re值高的流动被认为是湍流。Clark和Blanch认为Re<0.4是层流（斯托克斯）状态，Re=0.4-500是过渡流（艾伦）状态，而Re>500是湍流（牛顿）状态。作者还报告说，离心下的细胞和蛋白质沉降通常发生在层流（斯托克斯）状态下。如方程式4所示，梅给出了一个表达式，用于确定流动液体中运动粒子的Re值。
能量耗散率（EDR）：在离心过程中的沉降过程中，EDR代表了当颗粒移动并受到阻力时，流动流体损失动能的速度。该速率取决于粒子速度和阻力大小（方程式5）。每个细胞的特定EDR（єp）等于EDR除以细胞体积（方程式6）。
柯尔莫哥洛夫涡流长度（ℓ涡流）：在离心过程中，流体的动能从大涡流中消散，并级联成更小的涡流。短于细胞直径的Eddies可以杀死细胞。方程式7显示了如何计算柯尔莫哥洛夫涡流长度，就我们的目的而言，它代表了离心过程中最短的涡流。ℓ涡流值可用作可缩放参数，以保持DSC上相同的细胞剪切量。在方程式7中，γ是指流体的运动粘度（m2/s）。
细胞损伤指数（CDI）和模型拟合：乳酸脱氢酶（LDH）是哺乳动物细胞中存在的一种酶。由于它是在细胞破裂时释放的，分析人员经常在剪切评估中使用它作为细胞损伤的指标。例如，Shekhawata等人展示了使用阿法拉伐的Culturefuge 100（BTPX305H）DSC系统的细胞培养澄清过程的剪切应力值。该团队应用计算流体动力学（CFD）来预测剪切水平，然后根据离心机转鼓速度和进料流速的不同组合的测量LDH值验证了预测结果。
使用作者的LDH值作为响应变量，使用根据方程7计算的ℓ涡流值作为解释变量，我们应用JMP软件中的拟合模型函数和标准最小二乘个性来评估涡流长度模型对DSC系统中剪切水平的预测（图2）。图2显示了LDH浓度与计算的ℓ涡流值之间的线性关系。数据显示，涡流长度和截距的p值分别为0.0008和<0.0001。这两个值均<0.05，表明输入变量（ℓ涡流）和输出预测（LDH浓度）之间的关联强度具有高度的统计学意义。
因此，在DSC工艺放大过程中，应用恒定的ℓ涡流值可能是一种有效的剪切评估方法。
离心机的颗粒沉降能力：为了在不同品牌和型号的离心机之间保持相同的沉降能力，我们采用了恒定的Q/∑比。方程式8显示了如何计算DSC的该比率。其中，g表示重力加速度（9.8 m/s2），Θ表示离心盘的半锥角（以弧度为单位）。离心机制造商通常以度（°）报告该角度，但半锥角可以通过将角度乘以π/180°的系数从度转换为弧度。
斯托克斯固体颗粒沉降定律能够计算出在离心过程中可以去除的最小粒径（方程式9）。Ambler报告说，这种计算基于西格玛理论，因此给出的是名义值而不是绝对值。Pham补充说，对于给定的Q/∑比，计算出的粒径（dp，min）仅能实现50%的分离效率。
为DSC操作设置设计空间——沉降能力的截止标准：Pham报告称，使用DSC澄清的细胞培养收获的平均粒径为0.5μm。Parau等人报告称，默克公司的Millistak D0HC过滤器——可用作两步纤维素深度过滤过程的第一步——标称额定值为0.6-9μm。生物制造商通常根据操作规模交替使用此类过滤器和DSC。因此，在DSC操作设计空间中，将截止值（dp，min）设置为<0.6μm是控制粒径和沉降能力的好方法。
为DSC操作设置设计空间——涡流长度：对于处于生长稳定阶段的CHO细胞，Maschke等人观察到平均细胞大小为13.57μm±1.02μm。Nienow报告称，在大多数CHO细胞培养过程中，保持涡流尺寸>18μm应能防止流体动力学损伤。由于大多数哺乳动物细胞的直径<20μm，将ℓ涡流设置为<20μm应确保离心机在防剪切区运行。然而，在一项关于CDI的研究中，Shekhawat等人建议抗剪设计的LDH浓度为~1200ppm。该值相当于ℓ涡流长度为22μm。因此，保守的方法要求将ℓ涡流值设置为<22μm。
设置DSC设计空间——重力：相对离心力（g-Force）是离心机相对于重力旋转产生的径向力（方程式10）。Doran解释说，DSC的设计产量为5000-15000克，以尽量减少沉降时间和离心处理时间。细胞培养收获是一个清洁的过程，但不是无菌的。因此，制造商的目标是在四至六小时内完成大规模（20000-L）培养物的DSC收获操作，以尽量减少微生物增殖。Pham和Monica、Whiteley和Aktiengesellschaft 表示，他们分别应用了6500-7500克和8000-9000克用于基于DSC的细胞培养收获。我们将重力设置为>5000g，以便及时完成工艺。
图3显示了一个等高线图，显示了ℓ涡流、重力、Q/∑和dp、min值与离心机进料流速和转鼓速度的函数关系。我们公司生物制造设施中使用的60升BRPX 618 HGV-34 DSC系统（阿法拉伐）可以进行20000升的细胞培养。该图显示了与剪切和沉降能力相关的风险区域，以及在保持合理沉降能力的同时防止细胞损伤的操作空间。该图还表明，作为首选操作区域，Q/∑范围较窄（3.1×10-9m/s至4.1×10-9mm/s）。对于使用DSC进行细胞培养澄清，Pham建议Q/∑值范围为10-9m/s至2.6×10-8m/s。然而，Maybury等人和Iammarino等人描述的实验表明，随着Q/∑从3.4×10-9m/s增加到1.35×10-8m/s，澄清效率降低了6-10%。这些观察结果与图3所示的离心机设计空间一致。
方法2：
尖端速度平均剪应力：Boychyn等人指出，圆盘旋转表面上流体流动的最大剪应力水平（τmax）可以使用方程11确定。其中，θtip表示圆盘在半径R处的尖端速度。圆盘的平均剪切力是通过平均圆盘外半径和内半径（分别为Ro和Ri）处的剪切水平给出的（方程式12）。
剪切应力暴露时间：剪切对哺乳动物细胞的伤害程度不仅取决于其强度，还取决于其持续时间。Ludwig等人证明，长时间的剪切（例如24小时）会在0.75-1.0 N/m2的力下损害细胞形态；然而，在短时间内（长达一小时），细胞可以承受高达20N/m2的应力。Bae等人写道，需要>250 N/m2的剪切应力来诱导CHO细胞的机械损伤。因此，在澄清过程中模拟细胞损伤时，生物制造商应考虑暴露于剪切场的持续时间。方程式13计算DSC盘之间环形空间中沿轴向距离的细胞停留时间（ts）。Pham等人使用幂律模型将细胞损伤描述为剪切应力和剪切场暴露持续时间的函数（方程14）。
给定尖端速度下剪切应力的CDI和模型拟合：使用JMP软件中的拟合模型函数，我们得到了方程14中常数的值。我们基于Shekhawata等人在Culturefuge 100系统中不同操作条件下的LDH浓度进行计算，并将这些数据点用作响应变量。分别根据方程式12和13计算的τavg和ts值作为解释变量。这些输入产生了k=3.8、α=1.3和β=0.43的值，我们使用这些值来生成预测表达式（方程15）。
图4显示了报告的LDH浓度与方程式15之间的线性关系。R2值为0.98表明预测表达式可靠地拟合了观察到的数据点。同样，p值<0.0001表示输入变量（预测表达式）和输出预测（LDH浓度）之间的关联强度具有高度的统计意义，并且观察到的LDH浓度的99.99%的变异性可以用预测表达式来解释。因此，保持表达式恒定可能是在DSC操作的各个尺度上保持相似剪切水平的有效方法。
方法3：
功率耗散平均剪切应力：Murrell证明，DSC进料区（Pdis）中耗散的功率可以使用方程16计算，其中ω表示角速度（单位为1/s）。与尖端速度模型一样，耗散功率对细胞完整性的影响取决于暴露持续时间，可以使用方程17将其计算为离心碗停留时间（tRB）。其中，Vb表示离心机转鼓体积。基于这些计算，电池损伤指数可以用幂律表示为耗散功率和碗停留时间的函数（方程式18）。根据上述CDI和模型拟合方法，我们将方程18中的常数确定为k=0.16、α=0.98和β=1.4。这些值产生方程19所示的预测表达式。
图5显示了LDH浓度与方程19之间的线性关系。R2值0.98证明了预测表达的可靠性。p值<0.0001表示输入变量和输出预测之间的关联强度具有高度的统计意义，LDH值的99.99%的变异性由方程19解释。因此，保持预测表达式恒定有助于确保DSC操作范围内的剪切水平相似。
结论关于DSC操作的剪切评估：生物制造商在大规模生物制造过程中经常使用DSC进行细胞培养澄清。尽管有一种成熟的Q/∑方法可以根据颗粒沉降效率来缩放离心机操作条件，但目前关于DSC操作剪切评估的知识仍然很深奥。上面，我们使用三种方法进行了剪切评估计算。我们还使用轮廓图说明了应用，该轮廓图显示了颗粒沉降能力和剪切力之间的平衡，这是转鼓速度和离心机进料流速的函数。
