实验科普|什么是免疫荧光技术

文摘   2024-12-20 07:02   广东  

免疫荧光技术作为一种经典的细胞生物学研究方法,凭借其高特异性、高灵敏度和直观成像等优势,在生命科学研究中发挥着不可替代的作用。通过将荧光标记的抗体与特异性抗原结合,我们可以对细胞内各种生物大分子的定位、表达水平以及相互作用进行精细的观察和分析。

(图片来源:https://www.baslerweb.cn/zh-cn/learning/cameras-fluorescence-microscopy/)


发展历史

免疫荧光技术的起源最早可以追溯到1941年,Coons等科学家首次将荧光素标记到抗体上,成功实现了对组织切片中抗原的定位,标志着免疫荧光技术的正式诞生。随后,科学家们开始尝试将抗体分子与示踪物质结合,利用抗原-抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。经过几十年的发展,免疫荧光技术已经相当成熟,并在生物医学、病理学、细胞生物学等多个领域得到了广泛应用。

(图片来源:https://blog.cellsignal.cn/pathways-to-metabolism)


技术原理

免疫荧光技术的核心原理是抗原-抗体反应和荧光标记。

● 抗原-抗体反应:抗体分子能够特异性地识别并结合抗原分子。这种高度特异性的结合反应是免疫荧光技术的基础。

● 荧光标记:通过化学偶联的方式,将荧光染料标记到抗体分子上。当荧光抗体与靶抗原结合后,在激发光的作用下,荧光染料发射出特定波长的荧光,从而实现对抗原的定位和定量分析。


免疫荧光主要有两种方法:直接法和间接法。

● 直接法:直接法是指将荧光染料直接标记在一抗上,一抗与组织或细胞中的抗原特异性结合后,在荧光显微镜下观察。这种方法操作简单,但灵敏度相对较低。

● 间接法:间接法则是先用未标记的一抗与抗原结合,再用标记有荧光染料的二抗与一抗结合。这种方法的灵敏度更高,因为二抗可以放大荧光信号,但操作步骤相对较多。

(图片来源:https://sibet.cas.cn/kxcb2020/kpzp/202009/t20200929_5709332.html)


实验流程(间接法)

1.  样品制备:包括细胞培养、组织切片等。

2.  固定:使用化学固定剂(如甲醛、乙醇等)使细胞或组织的结构保持稳定,防止在后续处理过程中发生变形。

3.  通透化:对已经的固定细胞,进行通透化处理以破坏细胞膜,使抗体能够进入细胞内与抗原结合。

4.  封闭:使用封闭液(如血清、BSA等)封闭非特异性结合位点,减少背景荧光,提高检测的特异性。

5.  一抗孵育:将特异性的一抗与样品孵育,使一抗与靶抗原结合。

6.  洗涤:充分洗涤去除未结合的一抗,以减少背景干扰。

7.  二抗孵育:将荧光标记的二抗与样品孵育,二抗与一抗结合,从而将荧光信号放大。

8.  洗涤:去除未结合的二抗,确保图像清晰。

9.  封片:使用封片剂将样本固定在载玻片上,防止标本干燥和脱落。

10.  荧光显微镜观察:在荧光显微镜下观察样本,采集并保存图像,用于后续的分析和研究。





往期文章推荐

手把手教学|ImageJ软件在免疫荧光中的应用


实验解析|免疫荧光染色实验的注意事项


手把手教学|一文弄懂多重荧光免疫组化


手把手教学|间接免疫荧光实验






实验老司机分享生命科学实验知识,通过短视频、在线讲座、直播演示帮助新手实验操作者完成从0到1的入门学习。

exdrive.cn
公众号、视频号、知乎、Bilibili
抖音、西瓜、今日头条、小红书
内容同步


实验老司机
关注老司机,实验不死机。实验老司机分享生命科学实验知识,通过短视频、在线讲座、直播演示帮助新手实验操作者完成从0到1的入门学习。
 最新文章