全面充分地了解实验原理，掌握实验背后的底层逻辑；
熟悉实验的规范化操作流程，从一开始就养成规范操作的习惯（注：这点非常重要，有的同学可能做实验的时候马马虎虎，只追求结果，实验做出来了却连规范化的实验怎么做都不清楚，稀里糊涂的，还有可能把别人带“坑”里，查原始数据才发现实验都是错的，瞎折腾）；
尽可能地了解你所用到的实验设备和试剂，当然也要对比别的同学所用耗材，事无巨细，这是我们查找实验问题最关键的一步（注：此步在实验设计阶段尽可能有个大致了解，具体了解基本上是等实验正式开始真正用到了，但最起码得知道要用到什么东西吧）；
养成做好实验记录的好习惯：好记性不如烂笔头，最初实验设计是咋样的，后续进行了怎样的优化等等，越详细越好，任何一个被忽略掉的细节都有可能导致实验失败哦；
好的实验设计关键在于“灵活”，能保证条件随处可调的同时却不打乱实验节奏！
模板（cDNA）：2ul； 上游（下游）引物：0.4ul； 无酶水：7.2ul； 预混液Mix：10ul； 总体积：20ul
A基因用样本1做，B基因用样本2做，依次类推；
每个基因的不同稀释梯度分别用样本1/2/3来做，但要注意调换哦，因为原液用量肯定大，所以4个基因原液要都用样本1那样本1肯定在正式实验开始前就被用完了；
要注意新手对内参基因不熟悉的情况下最好也做预实验。
3 数据处理及统计分析
3.1 背景介绍
实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR，qPCR）的数据分析主要有绝对定量法和相对定量法两种方法。
所谓绝对定量法，即对未知样品的拷贝数进行测定的方法，如血样中的病毒、支原体、衣原体的定量分析、食品中某一转基因成分的含量分析等。
而相对定量法主要是以某一内参基因做对照，进而比较两个或多个样本之间某一目的基因表达量的差异，常用于检测mRNA表达量的变化，以及在不同组织中mRNA表达量的差异等。其中，相对定量法是最常用的方法，其数据处理又包含双标准曲线法和2－△△Ct 法两种，并以2－△△Ct法最为常用。
因此，接下来主要围绕相对定量法中的2－△△Ct法简要介绍qPCR的数据分析过程，并进一步通过GraphPad Prism 8.0对统计分析及绘图作一简单介绍。
3.2 相对定量法
(1)目的基因Ct值的归一化：
ΔCt（实验组）=Ct（实验组的目的基因）-Ct（实验组的内参基因）
ΔCt（对照组）=Ct（对照组的目的基因）-Ct（对照组的内参基因）
(2)实验组ΔCt的归一化：ΔΔCt=各样本的ΔCt-对照组的ΔCt
(3)表达水平的差异倍数：2 –ΔΔCT
3.3 数据处理及统计分析
(1)qPCR结束，得到原始数据，粘贴到Excel表格中，仅保留位置及Cq值（注：Ct值与Cq值表达的意思基本一致，实验指南建议用Cq值来命名，所以不必纠结两者的名称，同等看待即可；此外，一定要明确自己的加样位置，以防分析出错）；
(2)我们一般在实验中会设置复孔，所以第一步先求其平均值；
(3)第二步：计算ΔCt，用目的基因的Ct值减去内参基因的Ct值；
(4)第三步：计算对照组ΔCt的平均值；
(5)第四步：计算ΔΔCt，用ΔCt值减去对照组ΔCt的平均值即可；
(6)第五步：计算2–ΔΔCT（注：数据的排布方式可以按照个人习惯自由布局，另外样本较多时也仅需在此基础上添加即可，灵活变换哦）；
(7)复制粘贴2–ΔΔCT值为数据模式，打开GraphPad Prism 8.0，新建Column（注：此处以两组间比较为例）；
(8)复制粘贴数据至GraphPad Prism 8.0，点击Analyze，选择Normality and Lognormality Tests进行正态性检验，默认选项，点击OK，即可得到正态性检验结果；
(9)返回Table，点击t Tests，进行t检验 ；
(10)方差齐性检验：默认方差齐，方差不齐时返回Table，再次进行t检验，此时注意勾选第二个，即可得到统计结果。
(11)绘图：点击侧面Graphs里面的Data1（注：文件名都是可以重新命名的），即可生成图片；
(12)图片的美化及相关信息完善：此步操作简单，双击即可弹出格式设置窗口，按个人喜好选择即可，但仍需强调的是，一定要展示统计分析结果添加星号哦！
(13)全部处理完成，点击File→Export即可输出图片，还可以根据需要更改图片格式哦！（注：最好保留原始格式，这样后期只需要修改即可，无需再次分析和作图）
本文作者是"夏沫梦鸢"同学，在获得授权后，实验老司机将本文发表于公众号。
本文由作者根据自身经验总结而成，内容仅供参考。
文稿：夏沫梦鸢
校对：煲仔饭
素材：Canva
参考资料：
https://www.minipcr.com/product/qpcr-lab-principles-quantitative-pcr/
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