同源重组法质粒构建在基因功能研究、蛋白表达和纯化的等方面具有广泛的应用。内容包括了基因的敲除、敲低以及过表达等等，用于研究基因的功能、表达调控机制以及对细胞生理过程和表型的影响。另外通过优化启动子、核糖体结合位点等表达元件，以及选择合适的宿主细胞，利用同源重组法构建表达载体，使目的蛋白在宿主细胞中大量表达，从而达到目的蛋白表达和纯化的目的。
通过同源重组构建重组 MVA 载体
相较于传统酶切传统酶切法依赖于限制性内切酶对DNA的特异性切割而言，同源重组法质粒构建基于DNA分子间的同源序列进行重组。因此这里主要介绍同源重组法质粒构建的实验步骤和注意事项等。
一、流程图
二、实验步骤
1.获取插入目的片段：
（1）引物设计：在插入片段正反向扩增引物的5’端引入线性化载体两末端同源序列，使扩增后的插入片段5'和3'最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应一致的同源序列，长度一般为15-20bp，不包括酶切位点。
引物设计原则：同源臂+酶切位点+特异性引物（目的片段的一段序列），计算退火温度时只计算基因特异性扩增序列的Tm值，引入的同源序列和酶切位点不参与计算。
此时可以借助SnapGene软件进行协助，从NCBI获取到自己基因的目的片段序列导入SnapGene，在添加同源臂和酶切位点会更加直观，同时可以看见引物对的Tm值。
（2）PCR扩增：使用高保真聚合酶扩增插入片段，无需考虑产物末端有无A尾。为确保最优条件，可先设置梯度PCR确定最佳退火温度，再根据高保真聚合酶的特性配置PCR体系，并依据扩增片段的大小设置合适的延伸时间，确定最佳的PCR条件。
2.获取线性载体：
（1）选择克隆位点：挑选合适的克隆位点对载体进行线性化，优先选择无重复序列且载体克隆位点上下游20bp区域内GC含量在40%-60%之间的位点。
（2）选择线性化方式：可采用限制性内切酶消化或反向PCR扩增。使用限制性内切酶消化时，推荐双酶切方法使载体线性化完全，可以保证载体线性化完全；若使用单酶切线性化，则需适当延长酶切时间以减少环状质粒残留。而采用反向PCR扩增制备线性化载体时，要使用高保真聚合酶进行扩增，减少扩增突变的引入。
3.胶回收纯化：
根据载体和插入片段的大小确定相应浓度的胶进行胶回收。胶回收完成后琼脂糖凝胶电泳验证回收产物，用分光光度计（如 Nanodrop）检测插入片段和线性化载体的浓度以定量。
4.重组反应：
（1）稀释：计算重组反应所需的线性化载体和插入片段所需DNA量，并进行稀释扩大吸取量，确保各组分加入量不低于1ul。
（2）配置反应体系：冰上配置反应体系，用移液器轻轻吸打混匀，短暂离心将反应液收集至管底，另外酶置于冰上保存并最后加入。
（3）反应：将反应体系置于PCR仪器中，37℃反应30min，然后降至4℃或立即置于冰上冷却。重组产物可于-20℃存放一周，待需要时解冻转化。
5.重组产物转化：
（1）解冻感受态细胞：冰上解冻感受态细胞，如常用DH5α感受态细胞。
（2）加入重组产物：取适量重组产物加入到感受态细胞中，轻轻混匀，冰上静置30min。需注意重组产物转化体积最多不应超过所用感受态细胞体积的1/10。
（3）热激与复苏：42℃水浴热激45s后，立即置于冰上冷却3min，再加入新鲜LB培养基，37℃，200rpm摇菌复苏1h。
（4）涂板培养：将菌液离心，弃掉部分上清，用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在含有正确抗性的平板上轻轻涂匀，37℃培养箱中倒置培养12~16h。
6.重组反应产物鉴定：
（1）菌落PCR鉴定：挑取LB板上的单克隆若干个进行菌落PCR鉴定，扩增引物尽量选择载体部分序列上的引物，根据扩增产物的大小和使用的酶确定延伸时间和PCR程序，琼脂糖凝胶电泳检测克隆正确时应有长度略大于插入片段大小的条带出现。
（2）测序鉴定：对菌落PCR鉴定为阳性的菌落，可进一步接种培养后提取质粒进行酶切鉴定或者直接测序鉴定，以确保重组质粒的准确性。
三、注意事项
（1）引物设计：同源臂的长度一般为15-20bp，且GC含量应在40%-60%之间；计算引物Tm值时，仅考虑特异性引物部分，不包括同源臂和酶切位点。若引物长度超过40bp，在引物合成时可选用PAGE纯化方式，以提高阳性克隆率。
（2）模板选择：进行PCR扩增插入片段时，若目的片段较难扩增，可先使用不带同源臂的引物克隆目的片段，再以胶回收产物为模板，用带有同源臂的引物进行二次PCR扩增，但要注意此方法可能会引入较多突变。
（3）酶切与线性化：使用限制性内切酶进行载体线性化时，要确保酶切完全，可通过延长酶切时间或采用双酶切方法来实现。若使用单酶切线性化载体，需注意原生环状质粒残留可能导致转化不准确 。
（4）片段纯化：胶回收过程中要使用新的刀片，防止外源DNA污染。同时，要确保胶回收产物的质量和浓度，以便后续准确计算使用量。
（5）比例与用量：严格按照载体与插入片段的最适摩尔比1:2来计算和使用两者的量，以提高重组效率。若使用未经纯化的线性化克隆载体和插入片段扩增产物，其加入总体积应不超过反应体系体积的1/5。
（6）重组反应条件：重组反应需在冰上配置反应体系，移液器轻轻吸打混匀，避免振荡。反应温度和时间要严格控制，一般为37℃反应30min左右，反应时间不足或过长都可能降低克隆效率。
（7）转化过程：感受态细胞应在冰上解冻，加入重组产物后要轻轻混匀，避免损伤细胞。热激时间和温度要准确把握，热激后需迅速置于冰上冷却。此外，转化产物的涂布量也要适中，过多或过少都可能影响阳性克隆的筛选，此时，可以设置涂布的量和浓度。
（8）鉴定环节：菌落PCR鉴定时，要选择合适的引物和PCR程序，确保鉴定结果的准确性。对于初步鉴定为阳性的菌落，最好进行测序鉴定，以最终确定重组质粒的正确性。
本文作者是"旺旺仙贝"同学，在获得授权后，实验老司机将本文发表于公众号。
本文由作者根据自身经验总结而成，内容仅供参考。
文稿：旺旺仙贝
校对：煲仔饭
素材：
Okoli, Arinze & Okeke, Malachy & Tryland, Morten & Moens, Ugo. (2018). CRISPR/Cas9-Advancing Orthopoxvirus Genome Editing for Vaccine and Vector Development. Viruses. 10. 10.3390/v10010050.
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