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小麦条锈菌（Puccinia striiformis f. sp.tritici）是小麦条锈病的空气传播病原菌，造成小麦品质下降和严重的产量损失。小麦条锈病的有效田间管理在很大程度上依赖于对来源地的及时准确监测。因此，快速准确地检测条锈菌在疾病控制计划中是非常宝贵的。近日发表在International Journal of Biological Macromolecules杂志上题为“Rapid detection of Puccinia striiformis f. sp.tritici from wheat stripe rust samples using recombinase polymerase amplification combined with multiple visualization methods”的研究论文采用重组酶聚合酶扩增（RPA）技术结合不同的可视化方法，分别采用琼脂糖凝胶电泳法、RPA侧流试纸（RPA-LFD）技术和实时RPA技术，对条锈菌进行了快速且灵敏的检测。重组酶聚合酶扩增（RPA）是一种新的等温扩增技术，是目前最接近常温扩增的方法。该技术能够在恒温条件下，在相对较短的5-40分钟内扩增目标DNA片段。由于其快速、灵敏、简便等特点，已被应用于多种病原真菌、细菌、病毒的检测。为了满足不同的分析要求，还开发了各种方法来可视化RPA结果。三种RPA测定的过程和原理如图1和图2所示。条锈菌检测的RPA实验设置为在39℃下运行30 min。扩增后，纯化的上清在2%琼脂糖凝胶上电泳25 min，观察条锈菌分离物对应的条带。在不同的温度和时间下对RPA反应进行了测试，以优化反应。根据RPA产物凝胶图显示，选择以39℃和30 min作为RPA的最佳反应温度和反应时间（图3A、B）。根据实时RPA检测的指数扩增曲线，选择以39℃，20 min以及2.5μL醋酸镁溶液作为RPA-LFD测定的最佳条件（图3C、D、E）。![]()
图1 RPA检测系统的示意性工作流程
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图2 RPA系统的原理。(A)RPA测试的反应原理。(B)实时RPA探针（Exo-probe）的反应原理。(C)LFD-RPA探针的反应原理。(D)RPA引物和探针的序列信息。
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图3 RPA检测的优化。用RPA对条锈菌的基因组DNA在不同时间和温度下进行扩增，在39℃反应并完成于30分钟后，通过琼脂糖凝胶电泳可以观察到一条清晰的DNA条带，大小符合预期（179bp）。
采用阴性对照和基因组DNA样本对8种小麦叶片病原菌的RPA、RPA- LFD和实时RPA进行了验证。结果显示，只有条锈菌在RPA检测和RPA-LFD中被检测到（图4A、B）。同样，在实时RPA试验中，仅条锈菌观察到有可见扩增，而在其他7种小麦叶片病原菌或阴性对照中没有观察到可见扩增（图4C）。以上反应说明这3种RPA检测方法对条锈菌具有高度特异性。![]()
图4 RPA特异性、RPA- LFD和实时RPA分析。用103-108 fg模板DNA进行RPA、RPA-LFD和实时RPA分析表明，RPA和实时RPA的最低可检测浓度均为105 fg（图5B、D），RPA-LFD的最低可检测浓度为104 fg（图5C）。常规PCR和实时PCR的检测极限浓度分别为105 fg和103 fg（图5E、F）。![]()
图5比较RPA、RPA-LFD、实时RPA、常规PCR和实时PCR检测的敏感性。在野外检测的样品中，分别有44份（60.3%）、45份（61.6%）和60份（82.2%）样品采用RPA、实时RPA和RPA-LFD检测。统计结果如图6所示，这三种方法对条锈菌检测是有效和可靠的。![]()
图6现场样品的RPA分析性能。(A)现场样品三种RPA测定结果的直方图。(B) 73份野外样品的RPA测定。(C) 73个油田样品的RPA-LFD结果使用横向流量测试棒进行解释。(D)：实时RPA测定中现场样品的ΔRn值。本研究基于前人研究中获得的小麦条锈病真菌特定DNA片段设计了一套RPA引物，并将试纸、实时荧光定量与RPA相结合，建立了小麦条锈病快速检测系统。利用该系统对接种条锈菌的小麦进行田间试验。该系统为小麦条锈病的田间检测提供了方便、准确的工具，为小麦条锈病的综合治理奠定了基础。推荐阅读：
74份小麦种质材料叶锈病抗性鉴定及抗性基因分子标记检测（一麦众承 朱靖环）
小麦族多组学网站：http://wheatomics.sdau.edu.cn投稿、合作等邮箱：shengweima@icloud.com![]()
