研究背景
植物中的小RNA（sRNA）是一类长度为20至24核苷酸的非编码RNA分子，广泛参与基因表达的调控，在植物的生长、发育及抗逆过程中发挥至关重要的作用。sRNA主要包括miRNA和siRNA两大类。其中，phasiRNA（阶段性小干扰RNA）是siRNA的一种特殊形式，由miRNA触发生成，具有阶段特异性特征，广泛存在于禾本科植物中。研究表明，phasiRNA在植物雄性器官发育过程中具有关键功能，尤其在花药形成和减数分裂阶段。以水稻和玉米为代表的禾本科植物中，phasiRNA的时序性积累与花粉母细胞的形成密切相关。然而，关于phasiRNA在不同物种间的保守性与分化机制，尤其是在禾本科不同亚科中动态表达模式的具体功能特性，至今尚未得到全面解析。
近日，在Plant Cell发表了题为“Comparative RNA profiling identifies stage-specific phasiRNAs and coexpressed Argonaute genes in Bambusoideae and Pooideae species”的研究文章，首次系统解析了phasiRNA在竹亚科（Bambusoideae）和早熟禾亚科（Pooideae）植物中的动态积累模式及其与Argonaute基因（AGO基因）的共表达关系。研究通过RNA测序和降解组分析，揭示了phasiRNA在减数分裂前期、分裂期及分裂后期的表达差异和调控机制，提出phasiRNA的靶基因可能正在快速演化。
研究结果
1.禾本科植物花药发育的动态差异揭示亚科间的进化多样性
花药是植物雄性器官中生成花粉的关键结构，其发育特性在植物生殖成功中扮演重要角色。本研究通过对七种禾本科植物（包括六种早熟禾亚科植物和一种竹亚科植物）花药发育的表型分析，发现不同亚科植物的发育节奏和形态特征具有显著差异（图1）。例如，花药长度在不同物种间差异显著，从短柄草的0.7毫米到黑麦的12.5毫米不等。短柄草展现出快速的细胞分化和减数分裂进程，而竹亚科植物在减数分裂后期的发育节奏显著快于早熟禾亚科植物。竹亚科植物的花药表面紫色色素沉积较为显著，且分裂后期发育加速，而早熟禾亚科植物的花药以绿色外观为主，整体发育较为缓慢。这一显著的形态学和发育节奏差异表明，不同亚科植物可能存在特异的分子调控机制，从而适应各自的生态环境。问题在于，是否有共同的关键因子参与调控这些发育过程？
图1:实验中采样的植物物种及花药发育阶段的特征
2.花药miRNA家族的保守性与物种特异性
接下来，作者将研究重点放在了小RNA（miRNA）这一关键调控分子上。通过分析七种植物中花药miRNA的表达模式，揭示了尽管物种间差异显著，miRNA家族在某些方面表现出高度保守性。例如，miR2118和miR2275是所有物种中均高度表达的关键因子（图2），这些miRNA通过触发phasiRNA生成，在花药发育的调控中发挥了核心作用。然而，miRNA的表达模式也展现出物种特异性。硬粒小麦中，miR2118的拷贝数高达28，而竹亚科植物中仅有8个。此外，短柄草还发现了一些独特的候选miRNA家族，这些家族可能代表了miRNA的特化功能。这种特性表明，miRNA不仅在物种间保留了保守的调控作用，还通过差异化调控网络，适应不同植物的发育需求。那么，miRNA是如何通过调控下游基因（如PHAS位点）实现这些功能的？
图2:花药中miRNA家族表达模式在物种间的保守性有限
3. PHAS位点的数量与基因组特性
为了进一步揭示miRNA触发phasiRNA生成的具体机制，作者分析了PHAS位点在不同物种中的数量和分布情况。结果显示，PHAS位点的数量与植物基因组的大小和倍性水平密切相关。例如，六倍体面包小麦中，PHAS位点数量多达13,541个，而二倍体植物（如短柄草和竹亚科植物）中的数量相对较少（图3）。此外，PHAS位点在同源染色体间的分布高度一致，进一步表明基因组倍性扩展在其进化中起到了重要作用。这些结果提示，PHAS位点为phasiRNA的生成提供了基础平台，但不同物种中生成的phasiRNA是否在表达模式上表现出时间和功能的特异性？
图3:发育阶段中生殖相关phasiRNA的动态调控
4.花药中21-nt phasiRNAs的时间累积模式
因此，作者对21-nt phasiRNA的时间累积模式进行了详细分析。结果表明，不同物种的21-nt phasiRNA在发育阶段的表达峰值存在显著差异（图4）。在竹亚科植物中，21-nt phasiRNA的丰度主要在减数分裂期达到高峰，而在早熟禾亚科植物中，这一峰值则集中于减数分裂前期。此外，作者发现，21-nt phasiRNA的生成由高度保守的miR2118触发，其累积模式可能反映了phasiRNA在不同阶段发挥的特定功能。由此可见，21-nt phasiRNA的表达具有显著的阶段性和物种特异性。那么，与21-nt phasiRNA相比，24-nt phasiRNA是否也具有类似的动态积累特性？
图4:生殖phasiRNA中核苷酸的位点特征与组成特征分析
5.24-nt phasiRNA的多样化表达与生物发生机制
接着，作者聚焦于解析24-nt phasiRNA的生成机制及其在物种间的表达模式。分析结果表明，24-nt phasiRNA的表达具有显著的多样性。在早熟禾亚科植物中，24-nt phasiRNA的表达峰值主要集中在减数分裂前期，而在竹亚科植物中，则更多地积累于分裂期和分裂后期（图5）。miR2275作为触发24-nt phasiRNA生成的核心因子，其在不同物种中的功能和表达模式进一步揭示了24-nt phasiRNA的生成机制。此外，部分竹亚科植物还发现了非保守motif，这提示24-nt phasiRNA可能通过独立的调控路径实现其功能。这些phasiRNA是否在核苷酸组成和加载效率上也展现出独特的特性？
图5:采样物种中编码AGO蛋白基因的系统发育树及表达谱
6.phasiRNA相关关键基因的表达模式
为进一步探讨24-nt phasiRNA的功能特化机制，作者对phasiRNA的核苷酸组成特征进行了深入分析。结果显示，21-nt和24-nt phasiRNA在不同位点上表现出显著的核苷酸偏好性（图6）。21-nt phasiRNA在第1位和第19位偏好C/G核苷酸，而24-nt phasiRNA则在第23位偏好A/G。这些核苷酸偏好性直接影响phasiRNA在Argonaute效应器中的加载效率，从而决定其在不同发育阶段的功能实现。这种特性也进一步提示，phasiRNA的生成和功能可能受到其核苷酸组成的强烈影响。那么，这些功能实现是否与参与其生成的关键基因的调控模式相关？
图6:七个物种花药中基因的共表达分析
7. miRNA与phasiRNA靶点的特异性
为深入揭示phasiRNA生成背后的调控网络，作者对AGO、DCL和RDR等关键基因的表达模式进行了全面分析（图7、图8）。结果表明，这些基因的表达与phasiRNA的生成模式高度一致。例如，DCL5的高表达对应于24-nt phasiRNA在分裂后期的积累，而AGO1b和AGO4c则分别与21-nt和24-nt phasiRNA的加载密切相关。这些基因的精确表达反映了phasiRNA调控网络的复杂性和协调性。接下来的科学问题则是，phasiRNA是否在不同发育阶段中展现出特异的靶基因调控功能？
图7:采样物种中编码DCL蛋白的基因的系统发育树及表达谱
图8:采样物种中编码RDR蛋白的基因的系统发育树及表达谱
8. miRNA与phasiRNA靶点的特异性
最后，通过nanoPARE技术，进一步解析了miRNA和phasiRNA的靶点特异性。作者发现，21-nt phasiRNA的靶基因数量显著多于24-nt phasiRNA，且前者的靶点主要集中在减数分裂前期（图9、图10）。相比之下，24-nt phasiRNA的靶点数量更少，但可能通过表观遗传调控机制在分裂期和后期发挥作用。这些结果表明，phasiRNA在调控网络中不仅具有显著的阶段特异性，还展现出物种间的功能多样性，为进一步理解其生物学意义提供了重要线索。
图9:不同物种中花药miRNA靶基因的重叠性较低
图10:不同物种中花药21-nt phasiRNA靶基因的重叠性较低
总结与讨论
本研究首次通过系统分析揭示了phasiRNA在竹亚科和早熟禾亚科植物中的动态积累模式及其复杂的调控网络。研究表明，21-nt和24-nt phasiRNA的生成和表达在两个亚科间展现出显著的时序差异和阶段特异性，同时与关键基因（如miR2118、miR2275及AGO基因）的调控活动密切相关。此外，PHAS位点的数量与基因组倍性水平之间的关系进一步阐明了基因组扩展对phasiRNA生成和功能进化的重要影响。研究结果不仅深化了对phasiRNA在植物生殖发育中的功能理解，也为禾本科植物遗传改良提供了重要的理论基础。未来，结合单细胞测序和表观遗传学及更广泛的系统生物学方法，有望更全面地解码phasiRNA的生物学功能及其在作物改良中的实际应用潜力。
原文链接：
https://doi.org/10.1093/plcell/koae308
