通常来说，NLR抗病基因赋予作物对单一病原体的抗性，但近期研究发现一个NLR基因（Yr87/Lr85）能够同时抵抗两种病害（小麦叶锈病和条锈病），为研究作物抗病基因提供了新的思路，也有助于提高小麦抗病性和产量潜力。
今天分享的文献是2024年11月15日发表于Nature Communications的“A single NLR gene confers resistance to leaf and stripe rust in wheat”。研究者通过两种不同的方法从沙融山羊草（Aegilops sharonensis）和高大山羊草（Aegilops longissima）中找到了一个新的抗性基因Yr87/Lr85，这个基因能够同时提高小麦对叶锈病和条锈病的抗性，并利用病毒诱导基因沉默（VIGS）等技术验证了该基因的功能，通过转基因技术验证了该基因在小麦中的表达情况及其对叶锈病和条锈病的抗性效应。
有意思的是，研究者将Yr87/Lr85与已克隆的小麦族NLR抗病基因进行比较分析发现，Yr87/Lr85含有两个不同的LRR结构域，并且该基因仅存在于沙融山羊草和高大山羊草，通过系统发育分析表明，该基因的变异解释了大多数沙融山羊草和高大山羊草对叶锈病的抗性，突出了这些重要遗传资源在小麦抗病改良中潜在价值。
研究背景
小麦叶锈病和条锈病都是影响小麦生产的重要病害，如果不合理防治将会对产量造成严重影响。除了化学杀菌剂外，抗病基因 (NLR) 是保护小麦免受锈菌侵染的主要手段。尽管目前发现的NLR基因大部分能够产生广谱成株期抗性，但大多数NLR基因通常仅对单个病原体提供抗性。因此，需要多个 NLR 基因来提供持久的广谱抗性。
近年来，随着基因分离技术的发展，抗病基因的克隆数量逐渐增加。到目前为止，已经克隆了32个抗锈病基因，其中一半以上是在过去五年中完成克隆！并且其中许多基因来自小麦次级基因库，大多数基因是核苷酸结合富含亮氨酸重复序列（NLR）类型，每个基因编码识别某病原体效应蛋白的特异胞内识别受体。随着小麦遗传转化和基因编辑技术的发展，未来利用小麦次级基因库进行小麦抗病遗传改良将具有不错的前景。
沙融山羊草（Aegilops sharonensis）和高大山羊草（Aegilops longissima）等二倍体材料属于小麦次级基因库，具有非常丰富的农艺性状和遗传多样性，研究者从中鉴定到了一个叶锈病和条锈病抗性基因，并使用小麦渐渗系和突变体MutChromSeq分析，将涉及到的突变体进行转录组RNA测序，并使用AgRenSeq方法，在244份材料中进行遗传关联分析，揭示了Yr87和Lr85是这两个物种特有的NLR基因。与大部分NLR基因不同，Yr87/Lr85赋予对两种不同病原体的抗性。
研究结果
从沙融山羊草中克隆Yr87/Lr85
前期研究发现沙融山羊草中小麦条锈和叶绣的抗性渗入到Galil小麦品种，该抗性位点在D42渐渗系中被定位于6B-6S染色体上17Mb的区域，为了分离候选基因，研究者使用了EMS诱变技术对D42系的3086粒种子进行诱变，得到1158个M2家系，然后使用了对D42亲本没有毒力的条锈菌和叶锈菌分离菌株进行初步筛选，鉴定到了16个对分离菌株敏感的M3家系，并通过PCR证实了在16个M3家系中存在渗入片段。研究者通过纯合的感病个体与纯合抗病个体间进行杂交，后代F2出现单基因分离（感病 : 抗病 = 1:3），然后使用纯合感病个体与轮回亲本Galil产生表型一致的感病后代，表明对两种病原菌的抗性是由单个遗传位点控制。
为了分离该基因，作者采用突变转录组学方法，选择了五个EMS突变株系，分别使用条锈菌和叶锈菌接种，并在接种后0、24、48小时从叶片中提取RNA，在转录组测序后，分析了在多个时间点表达的候选基因，并且推测得到了TRINITY_DN6116_c0_g1转录本，该转录本在所有时间点表达，在所有五个突变株系中含有突变（其中一个株系携带两个突变），并编码具有核苷酸结合位点（NBS）和富含亮氨酸重复序列（LRR）结构域的蛋白质，突变株系中的所有单核苷酸多态性（SNP）均在相同的编码序列内，并导致氨基酸发生了变化，为了分析非编码区，作者进行了突变体测序，并获得了突变株系的高质量序列。将比对到高深度测序的D42组装体，揭示了候选基因序列在三个基因组的重叠群。
为了验证候选基因的功能，使用病毒诱导的基因沉默（VIGS），通过靶向两个非重叠的基因特异性序列来抑制其在D42系中的表达。VIGS显示候选基因的表达降低75%，并且对Pt和Pst分离物敏感，证实该基因是叶锈病和条锈病抗性所需的，暂时将候选基因命名为Yr87/Lr85。
为了可视化Yr87/Lr85蛋白结构，作者通过Alphafold2生成了其预测结构的三维模型。预测的蛋白表现出卷曲螺旋（CC）NLR的结构相似，包括常规NBS结构域和重复序列的马蹄形构型C末端LRR结构域。进一步的分析显示，LRR重复序列由两个预测的马蹄形结构组成，它们被一个短的间隔序列分开。EMS突变体中发现的所有氨基酸取代均定位于预测的蛋白质内的功能结构域。其中两个突变位于LRR结构域的面向外部的部分，这可能促进促进小麦对病原体识别的多样化。两个EMS株系在第一个LRR结构域中发生突变，导致对Pt和Pst分离物的抗性丧失。
这一发现表明LRR结构域可能赋予对不同病原体的抗性。
从高大山羊草中克隆Yr87/Lr85
为了寻找更多的抗锈病基因，作者筛选了244个Ae. longissima种质资源，并通过两种Pt分离菌株来接种苗期材料，得到了30%抗性频率的材料群体。为了鉴定小麦叶锈病抗性候选基因，作者使用AgRenSeq 分析流程，并通过NLR富集捕获测序技术和表型分析，通过244份材料二代短读长测序数据的denovo从头组装，使用NLR-Parser过滤序列，然后对137份表型特异的样本进行基于kmer的群体关联分析。
作者发现对两种分离菌株的抗性表型与两个contigs之间存在显著关联，这两个contigs位于参考基因组中的未定位区域。为了精确定位R基因，作者重新测序了Ae. longissima 基因组，并获得改进的参考基因组，因此能够将两个NLR候选区域比对到染色体6S上，令人惊讶的是，Ae. longissima抗叶锈基因和Ae. Sharonensis中Yr 87/Lr 85几乎相同，它们的大小完全相同（16207 bp），含有三个高度相似的内含子，并且具有几乎相同的外显子，外显子仅在三个同义核苷酸位置不同，并且产生具有1510个氨基酸的预测蛋白质。
表明作者使用两种不同的方法独立地从沙融山羊草（Aegilops sharonensis）和高大山羊草（Aegilops longissima）找出了一个抗锈病基因。
为了验证Ae. longissima对Pst和Pt的抗性，作者通过Fielder进行转基因实验，测试了转基因材料对Pt和Pst分离菌株的响应，结果发现三个cDNA转基因系均对Pt和Pst分离菌株易感，而三个gDNA转基因系显示不同程度的抗性。
反转录-定量PCR（RT-qPCR）分析显示，cDNA转基因植物中Yr 87/Lr 85的表达水平比gDNA植物中的表达水平低至少2.5倍。在cDNA转基因系中相对低的基因表达水平表明编码序列内的内含子对于适当的Yr 87/Lr 85基因表达很重要。此外，Yr 87/Lr 85基因的表达在侵染和未侵染的植物之间没有差异，并且由Yr 87/Lr 85赋予的抗性在相对较高的温度下不受影响，属于高温成株期抗性。作者还用来自北美的Pt和 Pst另外两个分离菌株测试了转基因系，并发现了高水平的抗性。为了检查Yr 87/Lr 85是否提供对其它病原体的抗性，作者用Pgt的两个分离菌株和小麦白粉病菌的三个分离菌株接种转基因Fielder材料，发现Yr 87/Lr 85具有对Pst和Pt的特异抗性。
Yr87/Lr85苗期和成株期抗性
为了研究Yr87/Lr85 提供的抗性机制，作者将野生型和携带Yr87/Lr85 的转基因 Fielder 小麦植株分别接种了Pt 和Pst 分离株，并使用 FITC 标记的小麦胚芽凝集素（WGA）对叶片样本进行染色（WGA 专门用于染色真菌细胞壁）。结果显示，在抗性植株的叶片组织中，Pt 和Pst 分离株虽然能够侵入并生长，但真菌的发育被显著抑制，而在易感的 Fielder 品种中，真菌占据的面积则大得多。
抗性反应在苗期和成株期中表现一致，共同的表型与Yr87/Lr85 基因在苗期和成株期中相似的表达水平一致。最后，作者发现Yr87/Lr85 基因在大多数组织中均有表达，但在根部除外。
使用二氨基联苯胺（DAB）对活性氧（ROS）进行染色的结果表明，转基因植株中 ROS 的积累水平低于野生型 Fielder 植株，但 DAB 染色区域却占据了更大的空间，这暗示了一种定量的防御反应，说明Yr87/Lr85 通过减缓病原体的发育来阻碍Pst 和Pt 的感染。尽管该基因不能完全阻止真菌的生长，但能够有效防止苗期和成株期的病害大面积扩张。
Yr87/Lr85只存在于山羊草中
作者在其他物种中搜索了Yr87/Lr85 的直系同源基因。以Yr87/Lr85 CDS 作为查询序列，对Ae. longissima 的基因组进行局部 BLAST 搜索，结果发现Ae. longissima 基因组中仅含有一个Yr87/Lr85 副本，而已发表的Ae. sharonensis 基因组中未发现Yr87/Lr85 的同源基因。
同源基因分析
为了探讨Yr87/Lr85 与已知 NLR 编码基因的关系，作者使用来自Ae. tauschii、Brachypodium distachyon、Hordeum vulgare（大麦）、Oryza sativa（水稻）、Setaria italica（黍稷）、Sorghum bicolor（高粱）、T. aestivum（小麦）、T. urartu 和Zea mays（玉米）的 NLR 的 NBS 结构域进行了大规模系统发育分析。结果显示，Yr87/Lr85 位于C24 系统发育分支内的一个亚分支，而该亚分支中不包含已知的抗性基因。水稻的PI5-1/PI5-2 和PII-1/PII-2 抗性基因位于与Yr87/Lr85 平行的姐妹亚分支上。进一步使用Yr87/Lr85 亚分支内的全长 NLR 基因进行系统发育分析，发现该亚分支仅包含来自Bambusoideae、Oryzoideae 和Pooideae (BOP) 类群的物种。
Yr87/Lr85 所属的直系同源基因组（orthogroup）包括四个 NLR 基因：Yr87/Lr85、Ae. tauschii EMT11349、大麦HORVU.MOREX 和T. urartu TRIUR315482P1。在 NCBI 等数据库中，以Yr87/Lr85 CDS 作为查询序列进行全局 BLAST 搜索，发现了来自三个物种（Triticeae、Poeae 和Brachypodieae）的植物中具有序列相似性。
作者进一步在六倍体小麦及其 D 基因组祖先Ae. tauschii 基因组中搜索Yr87/Lr85 的同源基因。结果显示与Yr87/Lr85 序列相似度最高的两个基因为Ae. tauschii 的推测抗性基因RGA1（与预测的Yr87/Lr85 CDS 相似度为 87%）和T. urartu 的RGA2 类抗性基因（核苷酸序列相似度为 83%），其他预测基因的序列相似性均低于 80%，且覆盖率低于 80%。有趣的是，以预测的Yr87/Lr85 蛋白序列进行的全局 BLAST 搜索显示，其与Ae. tauschii RGA1 的相似性仅为 79%，而其他序列的相似性均低于 65%。
综上所述，Yr87/Lr85 属于来自BOP 类群的一个大型 NLR 系统发育分支，并且在Triticeae 中仅有三个物种中存在推测的直系同源基因。为了验证Ae. tauschii RGA1 是否为Yr87/Lr85 的功能同源基因，作者分析了 15 个Ae. tauschii 品系对Pt 分离株的响应，其中 8 个品系携带RGA1，7 个品系缺失RGA1。结果显示，材料对Pt 的抗性与是否携带RGA1 无相关性。
功能基因与蛋白序列分析
为进一步确认RGA1 是否为Yr87/Lr85 的功能同源基因，作者通过病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术在Ae. tauschii 品系AEG-9907-0 中抑制了RGA1 的表达。结果表明，RGA1 沉默的植株在接种 Pt 后，与对照植株相比，未表现出任何差异，这进一步表明Ae. tauschii RGA1 并非Yr87/Lr85 基因的功能同源基因。
作者使用预测的Yr87/Lr85 全长蛋白序列和LRR 、NBS 结构域，以及此前克隆的NLR 基因的蛋白序列进行系统发育分析，结果显示，预测的YR87/LR85 蛋白与小麦TSN1（ToxA 敏感性蛋白）最为接近。然而，当使用CC 结构域分析时，发现序列相似性很低，这表明该结构域与先前克隆的NLR 基因有所不同。
通过FoldSeek 数据库对预测的Yr87/Lr85 蛋白结构进行同源性分析发现，其与几种预测的NLR 类型抗性蛋白具有部分结构相似性。然而，所有候选蛋白在 C 端部分均缺乏同源性，并且此次分析未揭示新的功能性或系统发育信息。基于上述分析，目前尚未识别出Ae. sharonensis 和Ae. longissima 中Yr87/Lr85 基因的功能同源基因。
地理分布差异与多样性
Ae. sharonensis 生长在地中海东部沿海的一条狭窄地带，其分布范围与Ae. longissima 重叠，而Ae. longissima 的分布更广泛，可以在更内陆和更南部的地区找到。为了全面分类Yr87/Lr85 在Ae. sharonensis 和Ae. longissima 中的等位基因多样性，作者对来自Ae. sharonensis（N = 204）和Ae. longissima（N = 244）多样性集合的RenSeq 数据进行了迭代的denovo 组装和kmer 分析。结果显示，Yr87/Lr85 表现为一种PAV变异形式，其中该基因在Ae. sharonensis 品系中存在于 36% 的样本中（73/204），而在Ae. longissima 中存在于 21% 的样本中（52/244）。
多重抗性NLR基因
在禾本科植物中，目前仅有少数多重抗性的NLR 基因，例如大麦（Hordeum vulgare）的Mildew locus a (Mla) 基因Mla3、Mla7 和Mla8。这三个基因不仅对适应宿主的大麦白粉病病原菌提供抗性，还分别对其他作物的主要病原菌具有抗性：Mla3 通过识别Pwl2 效应蛋白对水稻稻瘟病病原菌Pyricularia oryzae (Magnaporthe oryzae) 具有抗性，Mla7 和Mla8 则对小麦条锈病病原菌Pst 具有抗性。
在小麦中，据报道Sr15/Lr20 和Lr16/Sr23 对茎锈病和条锈病病原菌具有抗性，但这些基因尚未被分离，其分子特性未知。另有研究通过将Ae. sharonensis 的抗叶锈和条锈病位点导入面包小麦的 6A 染色体，发现抗性与两个独立的基因Lr56 和Yr38 相关，这两个基因在后代中分离开，与位于 6 号染色体的Yr87/Lr85 无关。因此，本研究中的Yr87/Lr85 是小麦中罕见的可克隆的NLR 基因之一，它能够对两种不同的小麦病原菌提供抗性。
Yr87/Lr85具有全生育期抗性
Yr87/Lr85 并未阻止病原菌的侵染，也未完全抑制病原菌，但通过减缓病原菌生长和阻止扩散进程表现出抗性。在这一点上，它更类似于只在成株期表现的慢锈抗性，而非通常在苗期即可观察到的完全抗性。然而，Yr87/Lr85 在苗期和成株期均表现出同等有效的抗性，因此应被视为一种全生育期抗性（ASR）基因。
Yr87/Lr85 的抗性是特异性针对叶锈病和条锈病的，对茎锈病或白粉病病原菌无效，因此其抗性范围不及Lr34/Yr18/Sr57/Pm38、Lr46/Yr29/Sr58/Pm39 和Lr67/Yr46/Sr55/Pm46 等基因，这些基因能够对四种病原菌均提供抗性。然而，Yr87/Lr85 对所有测试过的Pst 和Pt 分离株（包括高毒力菌株）均表现出有效抗性，表明它在育种中具有很高的应用潜力。
Yr87/Lr85 的抗性表型与茎锈病抗性基因Sr21 和Sr13 类似，这些基因也通过减缓病原菌发育提供部分抗性。Sr21 和Sr13 对茎锈病的抗性在高温条件下更为显著，而Sr21 的抗性水平与基因表达水平相关，但Sr13 的抗性则无此相关性。高温下，这两种基因的表达会上调病原响应基因，表明它们可能共享相似的途径和机制。与之相比，Yr87/Lr85 的表达是稳定的，不受病原菌、时间或温度的影响，其在苗期和成株期均提供同样的抗性，表明其抗性机制与Sr21 和Sr13 有所不同。
Yr87/Lr85的LRR结构域影响抗性
Yr87/Lr85 如何对两种不同的病原菌提供抗性？基于其他已知案例，假设其抗性是通过识别真菌效应蛋白触发的，则Yr87/Lr85 蛋白可能通过识别两种不同蛋白效应因子提供抗性，类似于N. benthamiana 的ROQ1，后者能够识别来自不同细菌种类的不同效应蛋白。沿着这一思路，由于两个LRR 结构域的突变会同时破坏对Pst 和Pt 的抗性，可以排除Yr87/Lr85 的两个LRR 结构域具有差异性作用的可能性。
另一种可能性是，类似于Tsn1 基因，它能够对来自三种不同坏死营养真菌病原菌的ToxA 效应蛋白产生敏感性，而这些病原菌分别引起叶枯病、黄斑病和条斑病。由于Yr87/Lr85 的基因序列在Ae. sharonensis 和Ae. longissima 中几乎完全相同，这两种假设目前均有可能成立。
Yr87/Lr85系统发育与进化分析
系统发育分析表明，Yr87/Lr85 属于BOP 类群中一个扩展的NLR 系统发育分支，其功能单倍型仅存在于Ae. sharonensis 和Ae. longissima 中。启动子、终止子、内含子或非翻译区的序列变异可能是Yr87/Lr85 在预测对Pt 的抗性方面缺乏完全解释力的原因，这在等位基因分析中已有暗示。与Yr87/Lr85 序列相似性最高的是RGA1 基因，其核苷酸序列与Yr87/Lr85 的相似性为 87%，氨基酸序列相似性为 79%，该基因存在于Ae. tauschii 中，Ae. tauschii 是六倍体小麦 D 亚基因组的供体，与Ae. sharonensis 和Ae. longissima 属于同一系统发育分支。
其他最近发表的基因组数据中预测的基因，包括 D 基因组小麦物种、Ae. tauschii 样本以及小麦ABD 基因组物种，其序列与Yr87/Lr85 的相似性均低于 80%。在Ae. tauschii 的不同品系中，RGA1 的存在或缺失，以及在Ae. tauschii 抗性品系中通过基因沉默抑制RGA1 的表达，对 Pt 分离株的反应均无影响。因此，RGA1 似乎并不是Yr87/Lr85 的功能同源基因。一种可能的解释是: 这两种病原菌可能具有一个共同的效应蛋白，这类似于小麦其他已知的抗性机制。
Ae. sharonensis 和Ae. longissima 关系密切，其所有高可信基因的平均序列相似性达到 98.6% 。然而，这两个物种中NLR 基因的平均相似性仅为 87%，表明每个物种均包含大量独特的抗性基因（NLR 基因）。对不同基因组中的NLR 进行系统发育分析，发现某些分支没有已克隆的抗性基因，而另一些分支富含已克隆的基因，可能代表了进化的热点区域。
总结展望
作者认为Ae. sharonensis 和Ae. longissima 多样性群体和基因组资源具有育种可用性，结合长读长测序技术（如 PacBio 技术）以及基于全基因组k-mer 的关联分析，将使研究人员能够系统性探索这些独特的遗传资源，并快速利用这些资源来改良小麦抗病能力。
本文为研究植物中NLR基因的功能及其进化关系提供了重要的参考和启示，可以进一步探究其在不同病菌感染中的作用机理，以及与其他NLR基因之间的相互作用关系，另外，可以进一步探究Yr87/Lr85基因在不同条件下的表达模式，以及其在植物生长发育过程中的作用。小麦野生近缘种是重要的基因资源库，尤其在抗病方面具有潜在研究价值，结合基因组学和群体遗传学分析，有望挖掘更多的抗病基因，促进未来小麦抗病育种进程。
原文链接： https://www.nature.com/articles/s41467-024-54068-6
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