淀粉约占小麦干重的65%-75%，是决定小麦产量和品质的关键因素，了解小麦淀粉的合成过程和分子调控机理对于培育高产优质的小麦品种进而生产优质的面食品十分重要。淀粉根据其消化特性分为快速消化淀粉（RDS）、慢消化淀粉（SDS）和抗性淀粉（RS）。RS具有改变结肠微生物群落、促进肠道有益菌繁殖、改善炎症反应、抗肿瘤及调节免疫等生理功能。根据抗性机理的不同，一般可将分为5类：物理包埋淀粉（RS1）、抗性淀粉颗粒（RS2）、回生淀粉（RS3）、化学改性淀粉（RS4）和直链淀粉-脂肪复合淀粉（RS5）。
近日，Food Bioscience在线发表了题为“Effect of wheat TaDOF6 overexpression on the molecular structure and physicochemical properties of grain starch and resistant starch”的研究论文，揭示了TaDOF6调控籽粒淀粉和RS3分子结构和理化特性的机理。
TaDOF6编码一个DOF家族的转录因子，包含50个保守的氨基酸残基，其中19个为高度保守的氨基酸残基。qPCR分析结果显示，TaDOF6主要在小麦籽粒发育过程中表达。具体来说，TaDOF6的表达在5-15 DPA逐渐增加，在15 DPA达到峰值，在20-30 DPA迅速下降，在30 DPA几乎不再表达。进一步的RNA原位杂交结果显示TaDOF6在糊粉层和胚乳细胞中表达水平较高（图1）。这说明TaDOF6在小麦籽粒灌浆期特异性表达，其可能在小麦籽粒发育过程中发挥重要作用。
图1 TaDOF6是一个DOF家族基因，在胚乳中特异性表达
亚细胞定位结果表明TaDOF6定位于细胞核中，酵母实验结果表明TaDOF6具有转录激活活性。为了进一步检测TaDOF6的转录激活结构域，作者将TaDOF6分成两个片段，并将其连接到pGBKT7线性化载体上，转化酵母并检测其在缺陷培养基上的生长情况。结果表明，含有C端结构域片段的酵母生长良好，且在X-α-Gal下呈蓝色（图2）。这些结果表明TaDOF6蛋白具有转录激活活性，且C端结构域是其转录激活区。
图2 TaDOF6是一个转录激活因子
作者将3个高表达的转基因株系（株系6、12和15）分别命名为OE1、OE2和OE3，测定了T6代转基因植株的农艺性状，结果表明TaDOF6过表达显著提高了籽粒的粒宽和千粒重（图3）。
图3 过表达TaDOF6转基因系的农艺性状
过表达TaDOF6显著提高了总淀粉含量和支链淀粉含量，但直链淀粉含量没有显著差异，导致直支比下降。与对照相比，OE1、OE2和OE3支链淀粉A链（DP 6-12）、B2链（DP 25-36）和B3+链（DP≥37）的比例显著提高，而B1链（DP 13-24）的比例显著降低（图4）。
图4 过表达TaDOF6转基因系淀粉的链长分布
过表达TaDOF6后，原生淀粉RDS含量降低了11.30%-18.86%，SDS和RS含量分别提高了36.50%-44.09%和30.95%-36.90%。湿热处理后，天然淀粉加工成RS3，RS含量显著增加。与对照相比，过表达TaDOF6显著降低了RDS和RS含量，显著提高了SDS含量。
与对照相比，TaDOF6过表达显著增加了原生淀粉粒数和A型淀粉粒比例（图5）。粒度分析结果表明过表达TaDOF6显著增加了D[4,3]、D[3,2]、D[1,0]、Dx（90）和ΔV，这与A型淀粉比例增加的结果一致。此外，过表达TaDOF6还增加了淀粉的相对结晶度和短程有序数（图6）。
与天然淀粉颗粒相比，RS3的相对结晶度显著增加。而与对照相比，过表达TaDOF6显著降低了RS3的相对结晶度。短程有序数和拉曼光谱的结果也证明TaDOF6过表达使RS3的晶体结构更加无序（图6）。
图5 过表达TaDOF6转基因系淀粉和RS3的形态结构
图6 过表达TaDOF6转基因系淀粉和RS3的晶体结构
过表达TaDOF6显著降低了原生淀粉的To、Tp和Tc，这可能是由于TaDOF6过表达系支链淀粉的A链比例较高，B1链比例较低。A链和B1链的比例分别与糊化温度呈负相关和正相关，较长的B1链可以形成较长的双螺旋，因此需要较高的解离温度。过表达TaDOF6显著提高了淀粉的PV、TV、BV、SV和PT，这可能归因于支链淀粉含量和A型淀粉比例的增加。
与天然淀粉相比，RS3的To、Tp、Tc、ΔT和ΔH值显著降低。热稳定性的降低可归因于长时间暴露在高温下使晶体区域氢键的破坏。TaDOF6过表达系和Fielder的RS3的To、Tp、Tc和ΔT没有显著差异，而TaDOF6过表达系的ΔH显著降低，这与结晶度降低的结果一致。通过湿热处理将淀粉制备成RS3后，变得难以糊化。因此，与天然淀粉颗粒相比，PV、TV、BV、FV、SV和SP显著降低。TaDOF6过表达显著降低了RS3的糊化特性。
总结：TaDOF6过表达显著增加了支链淀粉含量，同时淀粉颗粒尺寸增大，相对结晶度提高，这有助于淀粉的粘度特性的改善。此外，TaDOF6过表达减弱了RS3淀粉的晶体结构，降低了其糊化焓和糊化特性。该研究为TaDOF6转录因子如何影响原生淀粉和RS3的结构和功能的分子机制提供了新的见解。
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.fbio.2024.104754
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