研究背景：
Sclerotinia sclerotiorum是一种致病性极强的坏死营养真菌，能够感染包括油菜、大豆等在内的多种重要经济作物，造成严重的产量损失。植物通过复杂的免疫系统，包括模式触发免疫（PTI）和效应蛋白触发免疫（ETI），抵御病原体的侵染。然而，Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary通过分泌效应蛋白SsPEIE1等策略来抑制植物的早期免疫反应，增强其致病性。SsPEIE1能够通过与拟南芥超敏反应诱导蛋白4（AtHIR4）相互作用，阻止其寡聚化，削弱植物的免疫功能。文章旨在研究SsPEIE1如何通过与HIR蛋白的相互作用抑制植物的免疫反应，从而揭示S. sclerotiorum的致病机制，为控制该病原菌引起的病害提供新思路。
2024年10月30日，nature communications在线发表了题为“An effector essential for virulence of necrotrophic fungi targets plant HIRs to inhibit host immunity”的研究论文。这项研究中，研究人员发现植物病原真菌Sclerotinia sclerotiorum通过一个名为SsPEIE1的效应蛋白抑制植物的早期免疫反应，从而增强其致病性。为理解坏死营养真菌与植物免疫系统之间的复杂关系提供了新的视角，并为开发新的抗病策略提供了潜在的分子靶标。
研究结果
1、分泌蛋白SsPEIE1在S. sclerotiorum致病性中的关键作用
研究人员首先通过转录组分析发现，SsPEIE1在S. sclerotiorum感染早期的表达显著上调。这一现象表明，SsPEIE1在感染宿主的过程中起着关键作用，特别是在早期感染阶段时。为了验证SsPEIE1在菌核链球菌毒力中的作用，研究者构建了两个SsPEIE1基因敲除突变株（ΔSsPEIE1-1和ΔSsPEIE1-2），并与野生型菌株进行了比较。结果发现：与野生型菌株相比，ΔSsPEIE1突变株在拟南芥（Arabidopsis thaliana）叶片上形成的病斑明显更小，这表明SsPEIE1对S. sclerotiorum的毒力至关重要。 通过进一步检测相对的病原菌生物量，发现ΔSsPEIE1突变株的菌体生物量显著降低，进一步证实了SsPEIE1在维持病原菌毒力方面的关键作用。对SsPEIE1突变株进行了基因恢复实验，构建了补充表达株（ΔSsPEIE1-1-C1和ΔSsPEIE1-1-C2），结果表明表明SsPEIE1的缺失是导致突变株毒力降低的直接原因。补充表达的SsPEIE1可以完全恢复其毒力，说明该蛋白在菌核链球菌的致病过程中是不可或缺的。
图1 分泌蛋白 SsPEIE1 在菌核链球菌的毒力中起着重要作用
2、SsPEIE1转基因拟南芥对坏死营养真菌的易感性增加
研究者通过构建SsPEIE1转基因拟南芥植物，具体分析了表达SsPEIE1的转基因拟南芥植物对坏死性病原体（如Sclerotinia sclerotiorum和Botrytis cinerea）的易感性增加以及植物免疫反应受到抑制的现象。以研究分泌蛋白SsPEIE1对拟南芥植物（Arabidopsis thaliana）的免疫影响。研究结果表明，SsPEIE1通过抑制植物的早期免疫反应，使得表达SsPEIE1的拟南芥对坏死性病原体的易感性显著增加。具体表现为：病原相关分子模式引发的免疫信号传导（如MAPK激活和ROS爆发）显著减少以及免疫相关基因的表达受到抑制。这些免疫抑制的效果使得转基因植物对S. sclerotiorum和B. cinerea的抵抗力降低，表明SsPEIE1在抑制植物的免疫系统、增强病原菌感染能力方面具有关键作用。
图2 表达 SsPEIE1 的转基因拟南芥植物对坏死病原体的敏感性增强并抑制免疫反应
3、SsPEIE1与AtHIR4在植物质膜中的相互作用
通过酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid, Y2H）筛选，研究者发现SsPEIE1与拟南芥的超敏反应诱导蛋白4（AtHIR4）存在相互作用。AtHIR4是一种质膜定位的蛋白质，与植物的免疫反应密切相关。为了进一步确认这一相互作用，研究者使用了分裂荧光素酶互补成像（Split-Luciferase, Split-LUC）实验。实验结果显示，当SsPEIE1和AtHIR4共同表达时，产生了强烈的发光信号，表明它们在拟南芥细胞膜中存在直接相互作用。通过共免疫沉淀实验（Co-Immunoprecipitation, Co-IP），以进一步验证SsPEIE1和AtHIR4之间的物理相互作用。当标记的SsPEIE1与标记的AtHIR4在烟草（Nicotiana benthamiana）叶片中共同表达时，SsPEIE1与AtHIR4能够共沉淀，证明它们在植物体内存在稳定的相互作用。这种相互作用也在拟南芥原生质体中得到了验证，进一步表明SsPEIE1与AtHIR4的结合并非特定于一种植物，而是在不同植物系统中具有一致性。亚细胞定位实验结果表明SsPEIE1和AtHIR4在细胞膜上的共同存在。进一步通过渗透实验（plasmolysis）观察到，SsPEIE1和AtHIR4均定位于质膜微区，这种定位进一步支持了它们在植物免疫中的协同作用。
总结来说，SsPEIE1通过与质膜中的AtHIR4相互作用，阻止其寡聚化，从而抑制了拟南芥的免疫防御，显著增强了S. sclerotiorum的致病能力。这种作用机制为深入了解植物-病原菌相互作用的复杂性和坏死营养真菌的致病策略提供了新视角。
图3 SsPEIE1 与质膜中的拟南芥超敏诱导反应4（AtHIR4） 相互作用
3、AtHIR2和AtHIR4在抗坏死营养真菌中的重要性
为了研究AtHIR4在抵御坏死性真菌中的作用，研究者使用了T-DNA插入突变体生成了拟南芥hir4突变株，并通过回交获得了纯化的突变体。同时，研究者还构建了AtHIR2和AtHIR4的双突变体（hir24）以进行深入分析。hir4和hir24突变体在感染S. sclerotiorum和B. cinerea时表现出显著增加的易感性，表现为病斑面积增大和真菌生物量增加。这表明AtHIR4和AtHIR2在植物对坏死性病原体的抗性中起着重要作用。特别是在hir24双突变体中，病害的发展速度和病原体的积累明显加剧，进一步说明AtHIR2和AtHIR4之间可能存在功能冗余，共同参与了对坏死性病原体的抗性机制。
为了进一步验证AtHIR4在抵御坏死性病原体中的作用，研究者进行了ΔSsPEIE1突变株在hir4和hir24突变体中的致病性分析。结果显示，在hir4和hir24突变体中，SsPEIE1的ΔSsPEIE1突变株的致病性得到了显著恢复，这表明SsPEIE1通过靶向并抑制AtHIR4来削弱植物的免疫反应，从而促进了病原菌的感染。研究人员还发现，hir4突变体和hir24双突变体在几丁质（chitin）处理后对早期免疫标志基因（如FRK1）的上调表达显著降低，说明这些HIR蛋白在调控植物的早期免疫反应中也起着重要作用。在这些突变体中，MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）信号通路的激活和活性氧（ROS）爆发均受到了抑制，尤其是在hir24双突变体中，这种免疫反应的缺陷表现得更加明显。由此可见，AtHIR2和AtHIR4在植物免疫信号传导中是重要的积极调控因子。除了对S. sclerotiorum和B. cinerea的抗性外，hir4突变体对叶面半生物性细菌病原体Pst DC3000（Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000）的抗性也显著降低，这与SsPEIE1转基因拟南芥的表现一致。这说明AtHIR4不仅在对坏死营养性病原体的抗性中起作用，也参与了对其他类型病原体的免疫防御。
图4 AtHIR2 和 AtHIR4 在对坏死营养真菌的抵抗中起着重要作用
4、SsPEIE1通过竞争性结合抑制AtHIR4寡聚化
SsPEIE1通过与拟南芥中的超敏反应诱导蛋白4（AtHIR4）竞争性结合，显著破坏了AtHIR4的寡聚化过程。AtHIR4作为质膜定位蛋白，通过寡聚化来激活免疫信号，是植物抵御病原菌入侵的关键因素之一。研究表明，寡聚化的AtHIR4能有效激活MAPK信号通路、促进活性氧（ROS）爆发，并上调免疫相关基因（如FRK1）的表达，从而增强植物的抗病能力。SsPEIE1通过竞争性结合AtHIR4，阻止其有效寡聚，显著降低了AtHIR4的免疫活性。在进行的酵母三杂交和体外拉下实验中，SsPEIE1显示出强烈的结合能力，破坏了AtHIR4蛋白之间的相互作用，阻碍了其寡聚化过程。共免疫沉淀实验进一步证实了SsPEIE1在植物细胞中有效阻止了AtHIR4的寡聚化。
这种破坏对于植物的免疫系统有明显的抑制作用。寡聚化的AtHIR4在免疫信号传导中发挥核心作用，其功能受到抑制后，转基因拟南芥表现出免疫反应的显著削弱，包括ROS爆发减弱、MAPK激活减少以及免疫基因的低表达。这种免疫抑制使得植物对坏死性病原体（如Sclerotinia sclerotiorum）的易感性增加，病原菌的感染能力得以提升。
通过抑制AtHIR4寡聚化，SsPEIE1为病原菌的成功感染提供了有利条件，使得植物的免疫反应无法得到充分激活。这种策略代表了S. sclerotiorum通过效应蛋白削弱宿主植物免疫防御的关键机制，为我们理解病原菌与宿主免疫系统之间的相互作用提供了重要的洞察。这也为未来开发基于植物免疫强化的抗病育种策略提供了新的研究方向。
图5 SsPEIE1 与 AtHIR4 竞争性结合并破坏其寡聚化能力和寡聚化介导的抗病性
5、AtHIR4过表达增强植物抗性
AtHIR4的组成型过表达不仅增加了其蛋白的总量，还通过促进其寡聚化，显著增强了拟南芥的抗病能力。这种增强表现为更强的免疫信号激活和广泛的抗病能力，使植物能够更好地抵御包括坏死营养性病原体在内的多种病原体侵染。这一研究揭示了AtHIR4在植物免疫调控中的关键作用，并为未来的抗病育种策略提供了有价值的分子靶点。
图6 AtHIR4 的过表达增强了植物抗性
总结
文章通过揭示病原菌效应蛋白SsPEIE1与植物免疫因子AtHIR4之间的相互作用机制，为理解植物的抗病免疫提供了新见解。对小麦研究而言，主要在于揭示了病原效应子与植物免疫因子的相互作用机制，为小麦病原菌效应子的功能研究提供了新方向。同时，文中的HIR蛋白在植物免疫中的作用也为小麦中类似免疫相关基因的研究提供了参考。文中效应子通过竞争性结合抑制植物免疫因子的机制，也为深入理解小麦与病原菌之间的免疫抑制机制提供了新的思路，这些发现对探索小麦抗坏死营养性病原菌的策略具有重要的借鉴意义。
原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-024-53725-0
