研究背景
小麦是最重要的粮食作物之一,为全球约40%的人口提供了20%的蛋白质和能量。然而,越来越多的人食用小麦后产生不良反应,这些不良反应主要是由醇溶蛋白引起的,降低小麦中醇溶蛋白的含量对人类健康非常重要。
近日,Journal of Experimental Botany在线发表了题为“CRISPR/Cas9-mediated multiplex gene editing of gamma and omega gliadins: paving the way for gliadin-free wheat”的研究论文,作者利用CRISPR/Cas9技术编辑醇溶蛋白基因,创制了醇溶蛋白和过敏源含量低的新种质。
研究结果
1. 利用CRISPR/Cas9对γ-和ω-醇溶蛋白进行基因编辑
作者基于中国春参考基因组和Sanger测序获得的小麦品种BW208的γ-和ω-醇溶蛋白基因序列设计了8个靶向γ-和ω-醇溶蛋白基因的sgRNA,其中4个用于编辑γ-醇溶蛋白基因,2个用于ω1,2-醇溶蛋白,2个用于ω5-醇溶蛋白。值得注意的是,靶向ω1,2-醇溶蛋白基因的sgRNA也匹配了一些γ-醇溶蛋白基因,sgGamma9同时靶向γ-醇溶蛋白和ω1,2-醇溶蛋白(图1)。这些sgRNA被组合在四个CRISPR/Cas9表达载体中转化小麦品种BW208,对再生成功的152个系进行鉴定,共鉴定出59个Cas9阳性的小麦品系,并使其成熟和自交受精。
图1:γ-和ω-醇溶蛋白的结构、序列信息及sgRNA的位置信息
2. γ-和ω-醇溶蛋白的基因编辑获得了多种独特的醇溶蛋白组成
作者对所有59个T0系的T1籽粒进行分析,以明确基因编辑系醇溶蛋白的表达谱。从每个T0系中取10个T1半粒种子,使用A-PAGE分析醇溶蛋白的组成。在生成的不同的T0系中,转化pSSLGamma16质粒的4个系的醇溶蛋白显著减少,其中一个系缺失一条带,两个系缺失多条带,还有一个系整个γ-醇溶蛋白区域缺失(图2)。质粒pSSLOmega8和pSSLOmega9含有靶向ω-醇溶蛋白的sgRNA,其中两个sgRNA也靶向γ-醇溶蛋白,分别鉴定出24个和3个转化这两个载体的T0系,其中分别有8个和3个系表现出ω-和/或γ-醇溶蛋白表达模式的改变(图2)。转化pSSLOmega8的系ω1,2-醇溶蛋白强烈减少,但ω5-醇溶蛋白没有减少。此外,所有系的γ-醇溶蛋白减少,特别是Omega-2、Omega-12和Omega-35三个系。转化pSSLOmega9的系Omega-56和Omega-57表现出ω1,2-醇溶蛋白缺失和γ-醇溶蛋白减少(图2)。
图2:利用酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定基因编辑系的醇溶蛋白组成
3. 醇溶蛋白表达谱的改变是γ-和ω-醇溶蛋白基因缺失的结果
对于γ-醇溶蛋白,Sanger测序显示,携带载体pSSLGamma17的系均没有被编辑的序列。对携带载体pSSLGamma16、pSSLOmega8和pSSLOmega9的系,γ-醇溶蛋白基因检测到从-1到-561 bp的缺失,-1、-2、-21、-24和-559 bp的编辑事件最为丰富(图3)。只有一个携带pSSLGamma16载体的系插入超过40 bp,一个携带pSSLOmega8载体的系插入超过1bp。
作者在pSSLOmega8和pSSLOmega9质粒转化的品系中表征了sgRNA的编辑事件。许多系的醇溶蛋白基因在两个sgRNA之间出现缺失,许多位点的缺失长度超过100 bp。在pSSLGamma17和pSSLOmega9共转化的系,发现pSSLGamma17载体两个sgRNA编辑位点的单独缺失,还观察到位于sgOmega2和sgGamma9两个编辑位点之间的缺失(图4)。
图3:CRISPR/Cas9介导的小麦γ-醇溶蛋白基因缺失
图4:CRISPR/Cas9介导的小麦ω-醇溶蛋白基因中的Indel
4. γ-和ω-醇溶蛋白基因突变导致基因编辑植株中面筋蛋白含量急剧下降
利用RP-HPLC测定了不同株系面筋蛋白的组分,结果表明pSSLGamma16和pSSLOmega8质粒转化的株系的γ-醇溶蛋白最显著的减少,pSSLOmega9转化的株系,以及pSSLOmega8转化的部分株系,ω-醇溶蛋白的减少最为显著。值得注意的是,有些株系的α-醇溶蛋白含量也显著降低。与对照相比,所有编辑株系的面筋含量都显著降低(图5)。
图5:基因编辑系的蛋白和面筋含量
5. 通过杂交育种结合CRISPR/Cas靶向突变
从Omega-43的后代中选择一些系作为亲本和作者之前创制的α-醇溶蛋白缺失的基因编辑系杂交,在F3中分离出纯合的突变体,测定其醇溶蛋白组成和面筋含量,结果表明后代中α、ω和γ-醇溶蛋白和低分子量麦谷蛋白亚基的含量显著降低,用R5和G12单克隆抗体测定的面筋含量显著降低。
图6:杂交基因编辑系后代的表型分析
总结与讨论
作者利用CRISPR/Cas9技术编辑γ和ω-醇溶蛋白基因,获得了大量含有丰富变异的醇溶蛋白新种质,通过与作者之前创制的α-醇溶蛋白缺失的基因编辑系杂交获得了α,γ和ω-醇溶蛋白均降低的基因编辑系。
原文链接：
https://doi.org/10.1093/jxb/erae376
