研究背景
小麦土传病毒病是威胁我国冬小麦生产安全的重要病害,其在黄淮海冬小麦种植区每年的发病面积达到2000万亩以上。其病原为小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus,WYMV)和中国小麦花叶病毒(Chinese wheat mosaic virus,CWMV),传播介体为土壤中的禾谷多黏菌。此外,由于禾谷多黏菌的孢子具有很强的抗逆性,且携带病毒的休眠孢子在十多年后仍然具有侵染能力,使得化学防控手段对这类病害几乎无效,培育抗病品种成为当前最经济、有效的防控手段。目前,针对CWMV或两种病毒兼抗的抗源较少,生产上种植单一品种和病原力进化导致品种抗性丧失。近些年来,CWMV与WYMV呈现复合侵染现象,加重田间病害的发生。因此,阐明寄主防御小麦土传病毒病的广谱抗病机制,为小麦土传病毒病的防控和抗性品种的培育提供理论基础和技术支撑。
2024年10月22日,Cell Reports在线发表题为“The dynamic TaRACK1B-TaSGT1-TaHSP90 complex modulates NLR protein-mediated antiviral immunity in wheat”的研究论文。本研究揭示了不同类型的土传小麦病毒侵染小麦后通过编码特定的蛋白破坏TaRACK1B-TaSGT1-TaHSP90免疫复合体形成,干扰NLR类蛋白稳定性,从而促进病毒侵染的分子机制。
研究结果
1.TaRACK1B正调控小麦对CWMV抗性
以往研究发现支架蛋白RACK1在植物先天免疫信号激活和传递过程中发挥重要作用,但尚未发现RACK1参与宿主响应病毒侵染过程。本研究中,研究人员发现小麦中的TaRACK1B表达水平在CWMV侵染后被显著诱导,推测该基因可能参与小麦响应CWMV侵染过程。为了进一步验证TaRACK1B在CWMV侵染过程中的生物学功能,研究人员构建并获得了TaRACK1B过表达(OETaRACK1B)和功能缺失突变体(tarack1b)材料,并将其种植在有CWMV发病史的苗圃中。结果显示,与受体材料相比,OETaRACK1B植株在田间的花叶症状更轻,且病毒积累量更低；而突变体tarack1b在田间呈现出更加严重的花叶症状,且病毒积累量显著增加。这些结果表明TaRACK1B可能在小麦抵抗CWMV侵染中起到正调控作用。
图1 TaRACK1B正调控小麦对CWMV抗性
2.TaRACK1B-TaSGT1-TaHSP90免疫复合体鉴定和验证
RACK1作为支架蛋白能够结合不同类型蛋白,实现信号高效性和特异性传递,从而参与不同的代谢过程。为进一步探究TaRACK1B调控CWMV侵染的分子机制,研究人员利用LC-MS/MS技术对CWMV侵染后TaRACK1B潜在互作蛋白进行鉴定,发现TaSGT1和TaHSP90等免疫相关因子可能是TaRACK1B的潜在互作蛋白,推测TaRACK1B能够与TaSGT1和TaHSP90等免疫相关因子形成免疫复合体。随后,研究人员进一步利用Co-IP、双荧光素酶互补以及pull-down对三者间互作关系进行验证。结果表明,TaRACK1B能够直接招募TaSGT1,并与TaHSP90形成免疫复合体。此外,TaRACK1B N端的第二个WD结构域是其与TaSGT1互作的关键区域。
图2 TaRACK1B与TaSGT1和TaHSP90互作关系鉴定
3.RACK1和SGT1在NLR蛋白诱导HR过程中发挥重要功能
本研究中研究人员发现CWMV侵染后,寄主体内TaRACK1B能够招募TaSGT1和TaHSP90等免疫相关因子形成免疫复合体。那么,该复合体是如何激活寄主抗病毒免疫呢？前期研究发现RACK1能够促进ROS的积累来增强寄主对病原菌抗性。因此,TaRACK1B-TaSGT1-TaHSP90免疫复合体是否也会参与寄主HR激活呢？研究人员利用BSMV过表达体系在OETaRACK1B和tarack1b材料中瞬时表达依赖于SGT1触发ETI反应的NLR蛋白-TaRPS2,发现OETaRACK1B材料中ROS和PCD积累显著增加,而tarack1b材料中显著减少,表明TaRACK1B参与寄主HR的激活。随后,通过异源表达系统在NbRACK1和NbSGT1共沉默植株中,回补TaRACK1B和缺失第二个WD结构域的TaRACK1B突变体,发现NbRACK1和NbSGT1共沉默植株中回补TaRACK1和TaRACK1-DelWD2并不能增强ROS和PCD积累。这些结果表明TaRACK1B、TaSGT1和TaHSP90形成的复合体共同参与HR激活,且TaRACK1B是复合体激活HR的重要组分。
图3 RACK1-SGT1复合体是NLR诱导HR的重要组分
4.TaRACK1B-TaSGT1-TaHSP90复合体调节响应CWMV侵染的NLR蛋白稳定性
前期研究发现RACK1、SGT1、HSP90、RAR1等免疫相关因子形成的动态复合物,在维持NB-LRR受体的稳定性和成熟方面发挥重要作用。那么,TaRACK1B-TaSGT1-TaHSP90免疫复合体是否能够通过维持NLR蛋白稳定性来激活小麦抗病毒免疫？研究人员利用LC-MS/MS技术鉴定到两个潜在受到TaRACK1B-TaSGT1-TaHSP90复合体调控的潜在NLR蛋白(TaRGA5-like和TaRGH1A-like)。进一步研究发现这两个NLR蛋白的稳定性在TaRACK1B、TaSGT1和TaRACK1B/TaSGT1沉默植株中显著降低,表明TaRACK1B-TaSGT1-TaHSP90复合体对维持TaRGA5-like和TaRGH1A-like蛋白稳定性发挥重要作用。随后,瞬时表达或沉默这两个基因能够抑制或促进病毒侵染。这些结果表明TaRACK1B-TaSGT1-TaHSP90免疫复合体通过维持NLR蛋白稳定性,激活小麦抗病毒免疫,从而抑制病毒侵染。
图4 TaRACK1B-TaSGT1-TaHSP90复合体调节响应CWMV侵染的NLR蛋白稳定性
5.TaRACK1B和CRP蛋白互作验证
病原物在与寄主长期的“军备竞赛”过程中进化出各种机制来逃逸寄主免疫系统。那么,CWMV是如何突破寄主体内TaRACK1B-TaSGT1-TaHSP90免疫复合体介导的抗病毒免疫？研究人员利用酵母双杂交系统发现TaRACK1B能够与CWMV编码的CRP蛋白互作。随后,利用BiFC、双荧光素酶互补、pull-down和MST等体内外互作方法证实了TaRACK1B与CRP存在互作,且互作的关键区域为TaRACK1B N端第二个WD结构域。
图5 TaRACK1B与CRP蛋白体内外互作验证
6.CRP干扰TaRACK1B-TaSGT1互作抑制HR激活
由于CRP与TaSGT1同TaRACK1B互作关键区域相同,研究人员推测CRP蛋白可能竞争性结合TaRACK1B,干扰TaRACK1B-TaSGT1-TaHSP90免疫复合体形成。随后,研究人员利用通过酵母三杂交、体外竞争性pull-down和竞争性Co-IP证实了CRP通过与TaRACK1B互作,破坏TaRACK1B-TaSGT1-TaHSP90免疫复合体形成,从而抑制其介导的抗病毒免疫激活,有利于自身侵染。
图6 CRP抑制TaRACK1B-TaHSP90复合体调节的HR反应
7.7K通过干扰TaRACK1B-TaSGT1-TaHSP90复合体形成抑制HR产生
田间CWMV通常会和小麦土传病毒病的另外一种病原小麦黄花叶病毒(WYMV)呈现复合侵染现象。那么,TaRACK1B-TaSGT1-TaHSP90免疫复合体介导的抗病毒免疫是否对WYMV也具有抗性？研究人员利用酵母双杂交系统发现TaRACK1B能够与WYMV编码的7K蛋白发生互作,且互作关键区域为TaRACK1B N端第二个WD结构域。进一步研究发现WYMV 7K蛋白也能够竞争性结合TaRACK1B,干扰TaRACK1B-TaSGT1-TaHSP90免疫复合体形成,进而抑制抗病毒免疫激活,促进自身侵染。
图7 7K蛋白干扰TaRACK1B-TaSGT1互作抑制HR激活
总结
本研究解析了TaRACK1B-TaSGT1-TaHSP90模块的广谱病毒机制,以及来源于不同类型的土传小麦病毒编码的病毒蛋白通过破坏TaRACK1B-TaSGT1-TaHSP90复合体形成,抑制NLR蛋白介导的抗病毒免疫,为植物病毒与寄主之间军备竞赛提供新的见解。有利于加深理解植物病毒致病的分子机理,并拓宽植物NLRs介导的免疫途径在植物-病原物之间的作用,为生产上小麦抗病育种提供新基因和理论支撑。
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.celrep.2024.114765
