歪头、消瘦、红点和溃疡的牛蛙，应该如何救治？这里有答案！

牛蛙（Rana catesbeiana）在人工养殖过程中，容易遭受各种细菌性疾病的危害，是各地在牛蛙养殖过程中常见的问题。在遭受各种致病性细菌感染后，患病牛蛙会呈现出各种不同程度的疾病症状，其中呈现体表大面积大小不一“溃疡”症状的牛蛙，被牛蛙养殖业者称为“溃疡病”。在我国各地养殖的各种规格的患细菌性疾病的牛蛙中，呈现出“歪头”、“消瘦”、“红点”和“溃疡”症状的患病牛蛙是比较常见的（图1）。

图1示患细菌性疾病牛蛙“歪头”、“消瘦”、“红点”和“溃疡”等常见症状

当各地的水产养殖业者将这些患有“歪头”、“消瘦”、“红点”和“溃疡”症状的牛蛙送到实验室后，我们应牛蛙养殖业者的请求，完成了对养殖牛蛙疾病的诊治过程。即从患有“溃疡病”的牛蛙体内分离菌株后，再利用分离菌株完成对各种水产用抗微生物兽药的敏感性检测的基础上，参考各种水产用兽药对分离菌株显示出来的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC），比较了分离菌株对各种水产用兽药的敏感性。在筛选到适宜于治疗患病牛蛙的水产用微生物药物后，指导水产养殖业者对患病牛蛙进行的药物治疗。随后，对从呈现“溃疡”症状的牛蛙体内获得的分离菌株进行了种属鉴定。现将研究结果报告如下。

1.1患病牛蛙的外观症状

从2023年4月至2024年10月，由从浙江省温州、安徽省滁州地区、福建省漳州地区等地的牛蛙养殖业者，送来实验室请求协助诊治疾病的多批次患病牛蛙，观察患病牛蛙体表除少数个体存在“歪头”、“消瘦”和“红点”症状外，几乎所有患病牛蛙体表均存在程度不同“溃疡”症状。

1.2致病菌株的分离

取已经出现“溃疡”等疾病症状的患病牛蛙，在无菌条件下，从患病牛蛙的肾脏、肝脏和脑中采样，在脑心浸液琼脂培养基（BHIA，Difco）平板上作划线分离，培养72 h后，从培养皿中挑取单个菌落进行纯培养。从每位养殖业者送来的每批次患病牛蛙体内分离、纯化培养并收集4~5个菌株，做分离菌株的药物敏感性试验检测。同时，分别将分离菌株转接到试管內斜面培养基上，低温条件下保存备用。

1.3供试药物

所有的供试药物都是送患病牛蛙的养殖业者，在当地水产用投入品市场上，够买的农业农村部批准使用的水产用抗微生物兽药。本试验中选用的水产用抗微生物药物成分是恩诺沙星、盐酸多西环素、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和磺胺间甲氧嘧啶等，完成对每批次患病牛蛙体内分离的4~5个菌株的药物敏感性检测。

1.4 MIC的测定

参照日本化学疗法学会制定的标准法进行药物敏感性试验检测。首先将供试药物用适宜的溶媒预溶后，灭菌生理盐水分别稀释至1000.0~0.25mL/L的2倍稀释的系列药物浓度。然后用FWA培养基将各浓度的药液稀释10倍，从而使玻璃试管内培养基中的各种药物的浓度达到100.0~0.025 mL/L的2倍稀释的系列药物浓度。最后向盛有培养基的玻璃试管內加入10.0µL浓度为1.0×10⁶cfu/mL活菌液，将接种供试菌液后的试管置于25℃恒温培养箱中培养72h，经肉眼观察证实无细菌生长试管中的最低药物浓度，即为MIC。

1.5治疗用药物的选择及使用方法

根据水产用抗微生物兽药对分离菌株完成药物敏感性试验结果，分别选择氟苯尼考等适宜的水产用兽药作为治疗各地的患病牛蛙的药物。药物饲料的制作方法是将筛选到的适宜水产用兽药混合在面粉糊中，充分搅拌均匀后，再泼洒在牛蛙颗粒饲料上搅拌混合均匀，在阴凉处晾干后投喂。

在投喂添加水产用抗微生物兽药牛蛙饲料的同时，采用二氧化氯作为外用消毒剂，采取全池泼洒法用药，使养殖水体中的药物浓度达到0.3mg/L，以控制养殖池水中的致病性细菌。

2.1水产用抗微生物兽药对分离菌株的MIC

采用不同种类的水产用抗微生物兽药，对从出现“溃疡”症状牛蛙体内分离的部分菌株，完成的药物敏感性检测结果如图2所示。由图2所示结果可以看出，不同水产用抗微生物兽药对来自不同水产养殖区域患病牛蛙体内的分离菌株，呈现出来的抑菌效果具有很大差异。

图2各种水产用兽药对患“溃疡病”牛蛙体内分离菌株的抑菌效果

2.2药物治疗患病牛蛙的效果

根据各地牛蛙养殖业者，在使用我们推荐的对分离菌株具有较好抑菌效果的水产用兽药后，从反馈回来的药物治疗结果信息得知。从牛蛙养殖业者用药后的第3d开始，养殖牛蛙的死亡率就开始大幅度地下降，连续用药7d后，养殖患病牛蛙就基本上停止了死亡。

2.3分离菌株的种属鉴定

将从各地患病牛蛙体内中收集的19个分离菌株，送到中国水产科学研究院长江水产研究所协助种属鉴定的结果，分别为脑膜败血伊丽莎白菌（Elizabethkingia meningosepticum）、弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）、维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）、嗜水气单胞菌（A.hydrophila）、普罗威登斯菌属（Providencia spp.）、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）、脑膜脓毒性金黄杆菌（Chryseobacterium indologenes）等7种不同种属的致病性细菌。

最近，我们报道了从患“腹水病”的黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）体内获得的大量分离菌株，被鉴定为6种不同种属细菌的结果。在本研究中，从来自我国不同水产养殖区域且体表呈现“溃疡”症状的患病牛蛙体内获得的大量分离菌株，被鉴定为7种不同种属的细菌。在外观症状相同的水产养殖动物，其体内为什么会存在种属不相同的大量细菌？这些不同种属的细菌是否就是导致牛蛙发生疾病的致病菌？为什么针从患“腹水病”黄颡鱼和“溃疡病”牛蛙体内获得的分离菌株，完成对水产用抗微生物兽药的药物敏感性检测，选择其中的适宜水产用抗微生物兽药，就可以有效地治疗患病水产养殖动物的疾病？都是值得进一步思考和深入研究的问题。

按照通常的病原学理论，对某种疾病致病性病原的判定，均需要看是否符合所谓的“科赫法则，Koch’s postulates”，只有符合“科赫法则”的分离菌株，才能被判定为某种疾病的致病性病原生物。不过，水产养殖动物疾病的名称，大多是根据疾病症状命名的，譬如养殖鱼类的“烂鳃病”，现在的研究结果已经证明，能引起养殖鱼类“烂鳃病”的致病性生物就是比较复杂的，多种不同种类的生物均可以引起养殖鱼类发生“烂鳃病”。即使是养殖鱼类的所谓“细菌性烂鳃病”，多个种属的细菌均可能是养殖鱼类“细菌性烂鳃病”的病原菌。

本研究结果证明，在呈现“溃疡”症状的患病牛蛙体内，可以分离到属于多个种属的分离菌株。我们认为是当养殖牛蛙在受到恶劣养殖环境因子应激性刺激下，导致养殖牛蛙自身免疫系统的免疫防御功能下降时，在养殖水体中存在的各种具有致病能力的所谓条件致病菌（conditional pathogenic bacteria），均可能侵入到免疫防御功能已经低下的养殖牛蛙体内，最后导致养殖牛蛙呈现出包括“溃疡”症状在內的“歪头”、“消瘦”和“红点”等各种症状。

在本试验研究中，在主要显示出“溃疡”症状的牛蛙体内获得的分离菌株，鉴定为7种不同种属的致病性细菌，说明不同种属的细菌可以导致养殖牛蛙呈现出共同的“溃疡”症状。而在对这些分离菌株完成抗微生物兽药的药物敏感性检测的基础上，选择适宜的水产用抗微生物兽药，可以有效地治疗出现“溃疡”症状的养殖牛蛙疾病，也就说明了从出现“溃疡”症状的牛蛙体内，获得的分离菌株至少是与导致养殖牛蛙出现“溃疡”症状具有相关性的。

• 文/图 华中农业大学 陈昌福、武汉科研时代生物技术有限公司 周鑫军

• 本期编辑/ 张红