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这篇名为"Loss of PLK2 induces acquired resistance to temozolomide in GBM via activation of notch signaling"的文章发表于Journal of Experimental & Clinical Cancer Research杂志。

研究背景

1. 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶极化激酶2（PLK2）是一个关键的调节因子，它参与中心体复制、G1/S期过渡和突触可塑性。然而，PLK2在胶质母细胞瘤（Glioblastoma multiforme，GBM）的发生和化疗耐药性中的潜在功能仍然不清楚。

2. Notch信号通路是最为保守的信号通路之一，由于Notch信号通路对于GBM的多种恶性疾病至关重要，因此探究Notch信号通路在GBM中的潜在分子机制至关重要。

研究过程与结果

1. PLK2在TMZ耐药性的GBM中显著下调

作者为了研究TMZ耐药性的GBM中不同编码激酶的基因表达，使用先前发表的GEO数据库进行了层次双向聚类，发现PLK2是TMZ耐药性组中最显著受抑制的编码激酶基因之一（图1A）。此外，作者分析了GBM组织与非肿瘤组织的差异表达基因。结果显示，在两个数据库中PLK2的表达一致下调（图1B, C）。

如图1D所示，Venn图中显示了三个数据库中重叠的下调基因。总共有4个基因与TMZ耐药性和GBM均呈负相关，包括PRKACB、DGKZ、PLK2和RPS6KA5。综上所述，PLK2在与GBM和TMZ耐药性相关的不同表达中显示出显著差异。因此，我们在本研究中选择了PLK2作为候选基因。

2. PLK2表达降低与胶质瘤患者预后不良密切相关

为了更深入了解PLK2在GBM中的临床相关性，作者使用在线服务器GEPIA分析了TCGA GBM数据库。如图2A所示，与非肿瘤组织相比，PLK2在GBM中显著下调。

此外，作者研究了PLK2在包括星形胶质瘤、胶质母细胞瘤和寡突胶质瘤在内的不同病理亚型的表达模式。显然，与非肿瘤组织中PLK2的高表达相比，其他类型的胶质瘤的PLK2的表达被显著抑制（图2B）。此外，与非肿瘤组织相比，GBM的4个分子亚型，包括经典型（CL）、间充质型（MES）、神经型（Neural）和促神经型（PN），PLK2的表达明显受到抑制（图2C）。这些数据表明，PLK2的缺失是GBM的重要生物标志物，这促使作者更深入地研究PLK2和GBM的相关性。

作者另外进行了免疫组化染色，选择临床患者样本中测定PLK2的表达。结果显示，PLK2主要在初期胶质瘤和非肿瘤样本的胞质细胞膜中表达，然而，在GBM样本中，染色显著较低。KM生存分析显示，与PLK2表达较高的患者相比，PLK2表达较低的胶质瘤患者的总体生存期较短（图2D）。为了验证这些发现，分析了Rembrandt数据库中的676名患者的样本，观察到类似的结果（图2E）。

尽管接受了术后放疗或TMZ化疗，PLK2低表达患者的总体生存期仍然没有较好的改善。总的来说，这些数据表明，PLK2的沉默可能会导致疾病的恶化。

3. PLK2过表达降低GBM细胞的恶性程度

为进一步研究PLK2的功能，通过慢病毒转导将外源PLK2引入U87和U251细胞系，通过免疫荧光成像来测定转导效率（图3A）。qRT-PCR（图3B）和Western blot分析（图3C）显示，与阴性对照相比，PLK2过表达的慢病毒转导的U87和U251细胞中PLK2 mRNA的表达量显著增加。

为了探究PLK2过表达对GBM细胞肿瘤恶性程度的影响，进行了体外细胞增殖实验和集落形成实验。结果表明，PLK2过表达影响了细胞生长和自我复制能力（图3D-F）。

此外，PLK2过表达的胶质瘤细胞的凋亡率显著增加（图3G）。根据细胞迁移实验，PLK2过表达显著降低了U87和U251细胞系的迁移能力（图3H和I）。此外，建立了颅内异种移植小鼠模型以研究PLK2对肿瘤的影响。结果显示，大多数移植PLK2过表达U87细胞系的小鼠未形成肿瘤（图3J）。KM分析显示，上调的PLK2抑制了体内肿瘤生长，延长了异种移植小鼠的生存时间（图3K）。总的来说，这些数据表明，PLK2过表达降低了GBM细胞的恶性程度，包括体外和体内的增殖、迁移、自我更新和肿瘤的发生。

4. 上调的PLK2促进了GBM对化疗的敏感性

为进一步研究PLK2与TMZ耐药性之间的相关性，先进行了TMZ耐药的U87和U251细胞系构建，然后进行细胞活力实验。

如图4A所示，相比未经处理的原始细胞系，耐药细胞系对TMZ治疗表现出较低的敏感性。且U87和U251耐药细胞系中PLK2表达下调（图4B, C）。随后，将TMZ耐药细胞系过表达PLK2，qRT-PCR分析显示，与对照细胞相比，PLK2 mRNA表达在PLK2过表达的U87和U251细胞中显著增加（图4D）。同样，PLK2的蛋白水平也过表达上调（图4E）。随后进行了体外细胞增殖实验以研究PLK2过表达对获得性TMZ耐药性的影响。结果显示，增强的PLK2表达显著减弱了耐药的U87和U251细胞系的增殖（图4F）。

此外，流式细胞仪实验用于研究U87和U251耐药细胞系的凋亡情况，在TMZ处理下，PLK2过表达显著提高了耐药性胶质瘤细胞系的凋亡率（图4G）。此外，同样使用TMZ耐药的U87和U251细胞系构建了体内异种移植小鼠模型，结果显示，与对照组相比，移植了PLK2过表达的U87耐药细胞系的小鼠对TMZ治疗变得更为敏感。同样KM分析显示，在接受TMZ治疗时，PLK2过表达小鼠组的生存时间在单LK2过表达组的基础上延长（图4H）。

综上所述，这些发现表明，PLK2的确实促使GBM的TMZ耐药性增强，而上调PLK2表达增强了GBM对TMZ的敏感性。

5. PLK2的缺失激活notch信号增强了GBM对TMZ的抗性

正如之前所证明的，PLK2作为一个抑癌基因，减弱了GBM的化疗耐药性，为此，使用TCGA数据库和GSE16011数据库进行了生物信息学分析以深入研究由PLK2调节的潜在信号通路是至关重要的。

转录组文件分别根据PLK2的表达分成了两组。双向聚类分析显示了PLK2high和PLK2low GBM中的显著基因特征（图5A, B）。

然后进行了GSEA富集分析，以找出与PLK2负相关的信号通路。如图5C-F所示，Notch信号通路是唯一在两个数据库中的PLK2low组中同时富集的信号通路。因此，选择Notch信号通路作为PLK2的候选下游信号通路。

6. PLK2的缺失激活notch信号增强了GBM对TMZ的抗性

为了进一步确认PLK2和Notch通路之间潜在机制的结果，进行了qRT-PCR和Western blot实验。结果显示，PLK2的过表达显著降低了Notch信号通路的下游靶标在转录组和翻译水平上，包括HES1、cMYC、p21、Cyclin D3（图6A, B）。反之，PLK2的敲低显著增强了Notch信号通路的这些响应靶标的表达（图6C）。

为进一步探究结果的可靠性，作者在PLK2过表达的U87细胞中进一步过表达HES1（图6D）。值得注意的是，PLK2过表达会抑制细胞生长（图6E）、集落形成（图6F, G）和迁移能力（图6H），但在HES1同样过表达时抑制部分恢复，表明PLK2可能通过转录调控HES1，进一步通过沉默Notch信号通路降低GBM细胞的恶性程度。
为了进一步阐明PLK2对Notch信号通路激活的影响，用Western blot测定U87细胞系中活化的Notch1和Notch2的表达。结果表明，在PLK2的外源过表达后，notch1的表达明显降低，而notch2的表达没有明显受到影响（图6I）。
同样，PLK2的抑制增加了GBM中Notch1蛋白的表达，表明Notch1是PLK2可以通过其来失活Notch通路的重要调控因子（图6J）。为了验证这一点，使用MG132进行了蛋白稳定性实验，用于阻断蛋白质降解，使用PLK2过表达的U87细胞进行了MG132实验。结果显示，在U87细胞中，PLK2过表达后，Notch1的蛋白稳定性明显降低（图6K）。与这些结果一致，与对照组相比，在PLK2过表达的样本中，泛素化的Notch水平明显增加（图6L），表明PLK2的丧失通过抑制Notch1蛋白的降解来稳定Notch1，从而激活了Notch信号通路，最终导致获得性TMZ耐药和肿瘤复发。

研究总结

在这项研究中，作者发现PLK2在GBM中下调，而PLK2的升高与GBM患者的化疗敏感性和良好的预后呈正相关。此外，PLK2的过表达减弱了GBM细胞的增殖并增强了其对化疗药物的敏感性。证明了PLK2的丧失通过激活Notch信号通路，通过调控HES1的转录和Notch降解诱导了对TMZ的耐药性。总的来说，PLK2-Notch轴可能是TMZ耐药性GBM的预后生物标志物和潜在治疗靶点。