基因编辑技术是推动生命科学发展的驱动力，是现代生物技术的重要基石，精准性和高效性是各种基因编辑工具开发和优化的核心和基石。寄生病毒与宿主细胞之间不断的军备竞争推动了各种病毒入侵和抗病毒机制的发现，进而催生了基于病毒蛋白和宿主细胞抗病毒系统的基因编辑技术的建立，其中最具代表性的就是基于细菌抗噬菌体免疫系统建立的CRISPR-Cas技术和基于噬菌体重组酶建立的Red/ET重组工程。CRISPR-Cas系统以其高效性和易操作性成为当前最受欢迎的基因编辑工具之一，但在实现任意位点的精准编辑时仍面临挑战，特别是对于某些复杂的基因组区域或特定类型的突变，其编辑效率和精度仍然无法达到理想水平。Red/ET重组工程能够利用噬菌体来源的同源重组酶实现对宿主细胞基因组DNA的精准修饰。近年来，Red/ET基因编辑技术与CRISPR-Cas技术联合使用，已经实现模式细菌、真核细胞基因组的精准多位点编辑，在生物育种、生物制造等领域展现出巨大的应用价值。
Red/ET与CRISPR/Cas发展图
近日，山东大学微生物技术国家重点实验室张友明团队在Red/ET联用CRISPR/Cas9介导的细菌基因组多位点编辑技术开发和应用方面取得重要进展，相关研究成果以“ReaL-MGE is a tool for enhanced multiplex genome engineering and application to malonyl-CoA anabolism”为题发表在Nature Communications杂志上。
微生物代谢工程往往比初始预期的更具挑战性，许多对微生物工厂进行改造的尝试表明，新陈代谢是一个高度相互关联的多层次网络，几乎任何改变都会引发意想不到的后果。尽管已经进行了充分预测或者通过试错进行了大量测试，但由于网络调控和生长是耦合的，不同途径的异常过表达或低表达都会导致生长紊乱和代谢产物产出不理想。即使是在建模或随机选择策略的帮助下，微生物代谢工程中遇到的复杂问题仍需要能够超越低通量突变限制的策略来解决，因此多重突变势在必行。目前在细菌中，多重突变技术主要利用重组工程 (recombineering) 和CRISPR策略进行开发。本课题组前期工作首次发现了细菌胞内dNTP水平对于Red/ET重组工程的重要影响，建立了基于dsDNA重组工程的细菌多元基因组编辑方法 (dReaMGE)(Nucleic Acids Res, 2022 Feb 22; 50(3):e15)，dReaMGE技术极大的简化了细菌基因组多元编辑的流程，解决了dsDNA重组工程在多重基因组编辑技术中的缺失，对原核基因组工程具有广泛的意义。但是dReaMGE技术存在重组效率不够高、抗性基因标记依赖、标记回收耗时、引入重复序列等问题。CRISPR/Cas9是一种高效且通用的基因组编辑技术，但在细菌多重基因组靶向的应用受到多种因素的限制，包括Cas9的细胞毒性、同时共表达多个引导RNA困难，以及由于大多数细菌缺乏非同源末端连接能力而导致的未修复双链断裂的致死性。在本研究中，针对dReaMGE技术中存在的筛选标记依赖的问题，新技术中引入了CRISPR-Cas系统用于刺激重组和进行反向筛选；针对CRISPR-Cas系统介导基因组多位点编辑中面临的多gRNA表达载体构建困难、耗时费力的问题，在多种细菌中采取多gRNA的CRISPR-Cas系统线性化表达策略；针对多区域编辑效率受限于同源重组效率的问题，选择通过对核酸外切酶Exo VII的不同亚基(XseA和XseB)进行针对性调控，进一步提高同源重组效率。综合以上策略，研究人员联合dReaMGE技术和CRISPR-Cas技术建立了细菌多重基因组编辑技术ReaL-MGE(Recombineering and Linear CRISPR/Cas9 assisted Multiplex Genome Engineering)，该技术可以在一周内通过一轮编辑完成细菌基因组21个位点千碱基级别序列的同时插入编辑，而不引发任何脱靶问题。
图1︱ ReaL-MGE的技术原理
为了验证ReaL-MGE的功能，我们接受了代谢工程中最重要的挑战之一丙二酰辅酶A代谢网络改造。丙二酰辅酶A在细胞内的利用能力往往受到细胞代谢和生长的严格调控和竞争的限制，研究人员认为要在提升丙二酰辅酶A产量方面获得突破性进展，不仅需要增加丙二酰辅酶a的可用性，还需要兼顾改善宿主的生长性能，因此本论文利用ReaL-MGE通过多维策略 (i)丙二酰辅酶a代谢网络工程和(ii)基因组优化(竞争合成途径、基因岛、前噬菌体序列和转座酶删除)构建了多种丙二酰辅酶A高产底盘细胞。本论文首先利用ReaL-MGE构建了E.coli BL21丙二酰辅酶A高产底盘菌株，研究人员对E.coli BL21丙二酰辅酶A代谢途径中的21种关键酶以及基因组上7个基因组区域进行同时编辑，在fapO-FapR丙二酰辅酶A传感器的帮助下，筛选获得了胞内丙二酰辅酶A水平相较于野生型E.coli BL21菌株提高26倍的E. coli BL21.C33突变株，该突变株中14个靶标位点(14/28)同时发生了突变，全基因测序未发现有任何意料之外的编辑或脱靶现象，胞内丙二酰辅酶A含量达到1.165 nmol mg-1 DCW。研究人员将抗氧化、抗炎化合物芦荟松(Aloesone)生物合成基因簇(RpALS)表达质粒引入E. coli BL21.C33中，芦荟松的产量提高了11.4倍。
接下来，研究人员又应用ReaL-MGE对伯克氏菌目菌株S.brevitalea DSM7029进行丙二酰辅酶A代谢网络改造和基因组优化。研究人员选择S.brevitalea DSM7029丙二酰辅酶A代谢途径中的22种关键酶以及基因组上10个基因组区域进行了同时编辑。同样借助高效的fapO-FapR丙二酰辅酶A传感器筛选得到了胞内丙二酰辅酶A水平提高20倍的突变株S. brevitalea DSM7029Δglb.C21，该突变株中有17个基因组区域被同时修饰，全基因测序未发现有任何意料之外的编辑或脱靶现象。S. brevitalea DSM7029Δglb.C21的生长情况相较于野生型菌株也有所改善，S.brevitalea DSM7029固有的早期自溶现象被消除。研究人员利用S. brevitalea DSM7029Δglb.C21实现了抗肿瘤化合物埃博霉素(epothilones)的高效合成，epthilone C/D产量达到4.1/2.7 mg L-1。
图3︱ReaL-MGE在S.brevitalea DSM7029丙二酰辅酶A高产底盘细胞构建中的应用
ReaL-MGE在假单胞菌P. putida KT2440的丙二酰辅酶A底盘细胞构建中也表现出色。研究人员选择对P. putida KT2440丙二酰辅酶A代谢途径中的22种关键酶进行同时编辑。借助fapO-FapR丙二酰辅酶A传感器筛选到的P. putida.C177丙二酰辅酶A高产突变株中有11个基因被同时编辑，与野生型相比，细胞内丙二酰辅酶A含量增加了13.5倍。
图4︱ReaL-MGE在P. putida KT2440丙二酰辅酶A高产底盘细胞构建中的应用
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41467-024-54191-4
王雪课题组的主要的研究方向为基因编辑技术的开发以及编辑工具与宿主的适配机制。在PNAS、Nature Communications、Nucleic Acids Res等期刊上发表研究论文多篇。课题组长期招收微生物学方向优秀硕士、博士和博士后，欢迎志同道合的优秀人才加入。
