代谢重编程作为近几年国自然的新兴热点，已经有越来越多的小伙伴开始致力于热点的联合应用。今天小薇师姐就给大家分享一篇代谢重编程联合血管拟态的高质量文章，速来围观！
本文是由中南大学李昱堃今年5月等多个研究团队发表在Molecular Cancer上的文章。本文应用分子对接技术，并且以代谢重编程和血管生成为研究内容，全面揭示了ESM1通过利用缺氧肿瘤微环境中PKM2依赖Warburg效应增强卵巢癌中的脂肪酸合成和血管拟态的分子机制，这么精彩的思路还不快学起来！
1.利用分子对接与蛋白质相互作用分析，揭示了ESM1在PKM2的SUMO化以及二聚体形成中的关键作用，这对于深入探究ESM1在卵巢癌代谢重编程中的作用具有重要意义。
2.通过代谢重编程与血管拟态的关联性研究，揭示了ESM1-PKM2轴对细胞葡萄糖代谢的影响和对卵巢癌细胞生物学效应。
3.探索药物干预和分子机制，揭示了PKM2抑制剂对ESM1和PKM2分子相互作用的影响和对卵巢癌糖酵解、脂肪酸合成和血管拟态的抑制作用，为卵巢癌的治疗提供了新的思路。
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题目：ESM1通过利用缺氧肿瘤微环境中PKM2依赖Warburg效应增强卵巢癌中的脂肪酸合成和血管拟态
期刊：Molecular Cancer
影响因子：27.7
发表日期：2024年5月
公众号回复“123”领取原文PDF，文献编号：20241112
研究背景
缺氧肿瘤微环境是促进卵巢癌（OC）患者代谢重编程和血管拟态（VM）的关键因素。ESM1是一种能够促进OC增殖和血管生成的分泌蛋白。然而，ESM1在OC患者的代谢重编程和缺氧微环境中VM中的作用仍有待探索。
研究思路
主要结果
1.HIF-1α增强内皮细胞特异性分子1（ESM1）表达，促进体外缺氧微环境中卵巢癌细胞的侵袭和血管拟态
为了验证HIF-1α在OC细胞中上调ESM1表达，研究者将表达靶向HIF-1α的shRNA转基因 CAOV3和OV90细胞暴露于CoCl2 (200 µM)（一种低氧模拟剂）处理48小时。研究结果表明缺氧会增加HIF-1α的表达，而HIF-1α敲低会抑制ESM1表达，而ESM1 的敲低有效地抵消了缺氧条件下诱导的OC细胞迁移和侵袭的减少，波形蛋白表达减少和E-钙粘蛋白表达增加（图1A-F）。
图1 高HIF1-α上调ESM1，促进OC细胞的迁移和侵袭以及VM
2.HIF-1α增强ESM1以加速体内缺氧微环境中卵巢癌细胞的生长和血管拟态
研究通过IHC染色发现HIF-1α 敲低组中 PKM2、vimentin 和 VE-cadherin 的表达显著降低。同时CD31/PAS双染色结果也显示HIF-1α敲低组中VM水平显著降低。进一步分析TCGA数据库OC数据集中HIF-1α和ESM1之间的相关性，发现二者之间存在显著正相关性。此外，荧光素酶测定结果表明HIF-1α显著提高ESM1的转录活性（图1G-I）。
3.内皮细胞特异性分子1通过驱动AMPK/mTOR通路促进卵巢癌糖脂代谢重塑
研究通过蛋白组学分别在CAOV3细胞和OV90细胞中发现与ESM1相互作用的159个蛋白质存在重叠。KEGG分析显示，以上蛋白主要在碳代谢、糖酵解/糖异生、脂质和动脉粥样硬化通路中富集。其中，与ESM1具有最强结合能力的5个相关蛋白分别为PLEC、PKM2、ENO1、MYH9和HSPD1。研究通过油红O染色检测细胞内脂质的含量差异，发现ESM1过表达组的乳酸和ATP水平显著较高，葡萄糖和ROS水平降低，OV90和CAOV3细胞的脂质产生增加。此外，研究发现ESM1 表达抑制了细胞外酸化率 (ECAR)的增加，CAOV3 细胞中AMPK/ mTOR 通路相关蛋白以及 p-mTOR、FASN 和 SCD1 的表达增加，p-AMPK 减少（图2）。
图2 ESM1通过驱动OC细胞中的ATP/AMPK/mTOR通路来促进代谢重编程
4.内皮细胞特异性分子1通过二聚体PKM2依赖的Warburg效应促进卵巢癌的血管拟态
研究者通过Co-IP分析表明，内源性ESM1和PKM2在OV90和CAOV3细胞中相互作用，并且IF染色显示在OC细胞中强烈共定位。通过在293T细胞中过表达Flag-ESM1和GST-PKM2证明了外源ESM1在293T转染细胞中能够特异性结合PKM2。研究表明OC患者样本中ESM1 和PKM2及二者的mRNA均存在显著相关性。交联PKM2染色结果显示，ESM1过表达显著增加二聚体PKM2。而TEPP-46作为一种PKM2激活剂，能显著恢复ESM1过表达对OV90细胞中Warburg效应的影响，以及ESM1对乳酸、ATP、ROS产生和葡萄糖消耗的影响，恢复ESM1对VM 能力（图3）。
图3 ESM1通过与OC细胞中的PKM2相互作用来驱动Warburg效应
5.内皮细胞特异性分子 1 通过 UBA2-SUMO1 轴介导 PKM2 SUMO 化和二聚体形成
为验证ESM1介导PKM2 SUMO化以促进OC细胞中PKM2二聚体的形成，研究者将GST-PKM2和Myc-SUMO1共转染到HEK-293T细胞中，并利用Co-IP实验和蛋白质印记分析结果表明ESM1能够上调OV90和SKOV3细胞中PKM2蛋白SUMO化，并且GA可以逆转ESM1对PKM2蛋白与SUMO1 结合的影响。
此外，ECAR分析结果显示ESM1对OV90细胞中的Warburg效应有积极作用，并且经2-D08和GA处理可以恢复这种效应。WB分析显示ESM1对OV90细胞中UBA2的表达无影响，而UBA2的抑制阻碍了ESM1对PKM2 SUMO化的增强作用。蛋白质对接结果显示ESM1、PKM2和UBA2之间的相互作用可能对ESM1的分子功能至关重要。ESM1通过UBA2促进SUMO1的激活，作为连接激活的 SUMO1 蛋白与 PKM2 蛋白的介质，从而诱导 PKM2 SUMO 化（图4）。
图4 ESM1通过UBA2/SUMO1轴促进PKM2 SUMO1化驱动二聚体的形成
研究者鉴定了PKM2 的 SUMO 化位点IKII265 – 268。蛋白质印迹和ECRA分析显示，PKM2I267&268A不能与PKM2形成二聚体，并且不促进VM和糖酵解。此外，研究发现与野生型PKM2相比，即使ESM1上调，CAOV3和OV90细胞的侵袭能力和乳酸水平在PKM2I267&268A存在下均不再增强（图5A-F）。
6.内皮细胞特异性分子1通过调节其SUMO化驱动PKM2核转位
WB分析显示，ESM1过表达会促进CAOV3细胞中PKM2核转位，且ESM1诱导的PKM2 SUMO化促进其核定位，而SENP1则会有抑制效果。此外，研究表明ESM1能够在STAT3的磷酸化和下游基因的转录中发挥作用（图5G-K）。
图5 ESM1诱导的PKM2核易位依赖于SUMO化
7.PKM2 抑制剂紫草素可减轻卵巢癌和血管拟态的进展
本研究发现紫草素能够抑制ESM1与PKM2的结合，抑制ESM1过表达的OV90细胞中PKM2的表达及糖酵解。与ESM1过表达组相比，ESM1和紫草素组的乳酸水平降低，葡萄糖水平升高。此外，功能实验表明紫草素降低ESM1对CAOV3和OV90细胞迁移、侵袭和VM能力的影响（图6）。
图6 紫草素抑制ESM1与PKM2结合降低OC细胞VM和糖酵解能力
为进一步证明ESM1和紫草素对体内OC生长和VM的影响，研究者构建了OC异种移植肿瘤模型。研究结果表明，紫草素可以抑制ESM1的致癌作用，抵消ESM1对肿瘤体积和重量的影响。IHC染色结果显示，ESM1过表达会增加PKM2、波形蛋白、VE-钙粘蛋白和PCNA的表达及VM能力，但紫草素会抑制这些效果（图7）。
图7 紫草素抑制体内OC细胞生长、VM和糖酵解
文章小结
本研究揭示了ESM1通过PKM2 SUMO化促进二聚体的形成的分子机制，同时紫草素可以通过特异性抑制ESM1和PKM2之间的相互作用来阻止OC的进展，并且可以成为OC治疗的潜在候选者。想要做国自然热点研究的伙伴们注意啦！大家都在蓄势待发寻找好的热点和思路，如果你也对这个方向感兴趣，就快来联系小薇师姐定制你的专属实验方案吧！
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