中医药发文太卷咋办？暨大刘志平团队来教你：经典“搭子”网络药理学+分子对接，联合转录组发文12+！想复现的快上车！

自2020年新冠疫情以来，国家对中医药产业扶持力度与日俱增。小薇师姐发现在今年国自然的42个医学重点立项领域中，中医药项目就占据了其中的4项，尤其是在肿瘤领域。这不，今天给大家分享就是一篇中药活性成分治疗肿瘤的相关文章，研究内容相当丰富了，一起来看看吧！

这是由暨南大学刘志平研究团队今年10月发表在Theranostics期刊上的文章。本文以传统中草药丹参中的活性物质—隐丹参酮 (CTS)为研究角度，结合多种生物信息学分析方法及一系列体内外实验，全面揭示了CTS对腹主动脉瘤（AAA）治疗的分子机制，为AAA提供新的潜在的治疗靶点。

1.多模态实验方法的联合应用：通过建立动物模型、细胞培养、分子生物学技术、药理学分析和网络药理学等多种实验方法，使得研究结果更加全面和可靠，从不同层面深入探讨了CTS对AAA的治疗效果和分子机制。

2.分子靶点精准验证：通过分子对接、CETSA和ITC等先进技术章精确文验证了CTS与Keap1蛋白之间的相互作用，并确定了关键的氨基酸残基Arg415。不仅加深了对CTS作用机制的理解，也为开发针对性更强的药物提供了可能。

3.体内外模型相互验证： 研究分别在细胞模型和动物模型中对CTS的效果进行了评估。这种体内外模型的相互验证，增强了研究结果的说服力，确保了CTS作为潜在治疗药物的科学性和有效性。

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题目：隐丹参酮靶向平滑肌细胞 Keap1-Nrf2-GSDMD 焦亡轴可预防腹主动脉瘤形成

期刊：Theranostics

影响因子：12.4

发表日期：2024年10月

公众号回复“123”领取原文PDF，文献编号：20241106

研究背景

腹主动脉瘤（AAA）是一种炎症性、致命性主动脉疾病，目前缺乏有效的药物。隐丹参酮 (CTS) 是一种重要且廉价的生物活性物质，源自一种著名的中草药—丹参，其抗炎特性可以治疗心血管疾病。然而，CTS对AAA形成的治疗作用仍有待探索。

研究思路

主要结果

1.CTS 抑制 ApoE-/- 小鼠中 Ang II 诱导的 AAA 形成

通过CTS对Ang II诱导的ApoE-/-小鼠AAA形成的影响进行探究，研究发现接受CTS治疗的小鼠AAA发生率显著降低，生存率升高。腹主动脉的最大直径减少，降低了弹性蛋白损伤和退化，减少了巨噬细胞浸润，并恢复了血管平滑肌细胞（VSMCs）的收缩表型标记物表达，如α-SMA和SM22α。此外，CTS还降低了基质金属蛋白酶（MMPs）的表达和活性。这些结果表明，CTS可以通过抑制VSMCs的炎症反应、氧化应激和细胞死亡，维持VSMCs的稳态，从而有效预防Ang II诱导的AAA形成。    

图1 CTS抑制Ang II 诱导的 AAA 形成

2.CTS 在体外 AAA 模型中协调 VSMC 表型、炎症、氧化应激和线粒体功能

研究者发现CTS能够剂量依赖性地抑制肿瘤坏死因子α（TNF-α）诱导的VSMCs中血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）和MMPs的蛋白表达，减少炎症反应，并维持VSMCs的收缩表型。同时，研究发现CTS能够通过抑制TNF-α、改善线粒体功能和减少线粒体DNA（mtDNA）释放从而抑制ROS的产生。这些结果表明CTS通过抑制VSMCs的炎症、ROS产生和线粒体损伤，维持VSMCs的稳态，在体外模型中对AAA具有潜在的保护作用。    

图2 CTS在体外AAA模型中协调VSMC表型、炎症、ROS产生和线粒体功能

3.网络药理学结合转录组分析表明CTS激活Keap1-Nrf2-HO-1通路并抑制细胞死亡通路

研究通过网络药理学和转录组测序分析发现，CTS能够激活Keap1-Nrf2-HO-1信号通路，并通过抑制细胞死亡途径来预防AAA发展。研究者确定了CTS和AAA共有的关键靶点，并通过RNA测序进一步证明了CTS处理后Nrf2靶基因的表达上调，特别是Hmox-1（HO-1的基因名）的显著增加。以上结果表明CTS对炎症和细胞死亡途径的调节作用与其在预防AAA中的效果密切相关，为CTS作为AAA潜在治疗药物提供了分子层面的证据。    

图3 CTS激活Keap1-Nrf2-HO-1通路，抑制细胞死亡通路

4.CTS激活Keap1-Nrf2-HO-1通路并抑制VSMCs焦亡通路以预防AAA

研究发现在Ang II诱导的ApoE-/-小鼠模型中，CTS处理显著提高了主动脉组织中Nrf2和HO-1蛋白的表达水平，同时在体外培养的VSMCs中也观察到了同样的结果。此外，CTS处理的VSMCs中Nrf2在细胞核和细胞质中的表达均增加，尤其是细胞核中的增加更为显著。这些结果表明，CTS通过激活Nrf2信号通路，增强了VSMCs的抗氧化能力，对AAA的发展具有抑制作用。

图4 CTS激活VSMCs中的Keap1-Nrf2-HO-1通路预防AAA    

与对照组相比，Ang II诱导的AAA小鼠模型中Gsdmd mRNA水平显著升高，而CTS处理能够抑制这种升高。研究发现CTS能够显著抑制了NLRP3、Cle-Caspase1、N-GSDMD、IL-1β和IL-18等关键焦亡途径蛋白的表达。免疫组化（IHC）和电子显微镜（SEM）观察也进一步证明了CTS对VSMCs焦亡形态变化的影响。这些结果表明CTS能够有效抑制VSMCs的焦亡，减少炎症反应，对AAA的发展起到保护作用。

图5 CTS抑制VSMC焦亡，预防AAA发生

5.CTS与Keap1的Arg415残基结合，激活Nrf2通路，改善氧化应激和炎症

研究通过细胞热位移分析（CETSA）和等温滴定量热分析（ITC）发现CTS能够显著提高Keap1蛋白的热稳定性。分子对接及位点定向突变实验（Arg415Lys）结果表明CTS与Keap1的Arg415残基之间的具有高亲和力。此外，免疫共沉淀结果表明CTS处理能够减少Keap1与Nrf2的结合，并降低Nrf2的泛素化水平。这些结果表明，CTS可以直接与Keap1的Arg415位点结合，并且激活Nrf2信号通路，发挥其抗氧化和抗炎作用。    

图6 CTS与Keap1的Arg415残基结合激活Nrf2

研究者将Keap1野生型（Keap1-WT）和Keap1 Arg415Lys突变型（Keap1-R415K）质粒转染到VSMCs中，发现CTS处理能够显著降低转染Keap1-WT的VSMCs中ROS水平。此外，CTS诱导的Nrf2和HO-1蛋白表达在Keap1-WT组中显著增加，而在Keap1-R415K组中这种增加被抑制。这些结果表明，CTS通过与Keap1 Arg415位点结合激活Nrf2通路，减轻氧化应激和抑制VSMCs焦亡，而这一过程在Keap1-R415K突变背景下受到阻碍。

图7 CTS通过激活Nrap2和抑制焦亡减少ROS的产生

6.抑制Keap1-Nrf2 通路可逆转 CTS 在体外 AAA 模型中的保护作用

研究发现Nrf2转录抑制剂ML385能够逆转CTS在体外模型中对AAA的保护效果，包括CTS对MMPs和VCAM-1蛋白水平的抑制作用，以及对MMPs和炎症相关细胞因子mRNA表达的下调作用。此外，ML385还降低了CTS对VSMCs收缩表型标记物表达的恢复作用，降低ROS水平，抑制NLRP3-Cle-Caspase 1-N-GSDMD介导的焦亡途径。这些结果表明，CTS通过激活Nrf2信号通路来维持VSMCs稳态，并抑制VSMCs焦亡。

图8 Nrf2抑制逆转了CTS的体外保护作用

7.VSMC 特异性 Nfe2l2 敲低消除了 CTS 在体内小鼠 AAA 模型中的保护作用

研究发现通过尾静脉注射携带shNrf2的腺相关病毒（AAV）载体，可以特异性地在VSMCs中降低Nrf2表达，显著削弱了CTS对Ang II诱导的ApoE-/-小鼠AAA形成的抑制作用，导致CTS治疗效果受损。此外，研究者发现Nrf2在VSMCs中对CTS诱导的Nrf2稳定化和激活至关重要，Nrf2的敲减阻断了CTS对炎症、VSMC表型转换和MMPs水平的抑制作用。这些结果表明CTS通过激活Nrf2介导的抗炎效应和抑制NLRP3-caspase1引发的焦亡来治疗AAA。    

图9 VSMC特异性Nfe2l2敲除可消除CTS在AAA模型中的保护作用

通过特异性敲减VSMCs中的Nrf2，研究者发现CTS在体内模型中的抗炎、抗氧化以及抑制MMPs活性和生成的效果被显著削弱。这些结果证明了Nrf2在CTS治疗AAA中的关键作用，揭示了CTS通过激活Nrf2信号通路来发挥其治疗效果的分子机制。

图10 SMC特异性Nfe2l2敲除消除CTS对体内抗炎、抗氧化、抑制MMP活性和生成的影响

文章小结

本文结合了转录组、网络药理学、分子对接和体内外实验多种方法，首次揭示了CTS对AAA 的保护作用，并为CTS抑制AAA的分子机制提供了一些见解，为AAA治疗开发了一种有前途的药物疗法。真是一篇精彩的文章啊！本文思路环环相扣，逻辑紧密，方法丰富却并不复杂，同样做中医药研究的小伙伴们可以参考这篇文章的思路复现哦！对思路有疑问或者技术上遇到困难的小伙伴都可以来找小薇师姐聊聊，这里有专业团队为你解决方案设计、数据分析上的难题哦~

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