坚持每天19点准时推送思路上分干货，让科研变得更简单~
想第一时间收到小薇师姐的发文攻略，别忘了点个关注、加个星标哦！
小薇师姐建立的专业交流群，是谁还没加入？还可以找小编获取“神经科学SCI杂志2024最新影响因子（282本）”
在探讨新生儿高胆红素血症（HB）对大脑的潜在危害时，我们不禁要问：胆红素，这种通常与黄疸联系在一起的化合物，是如何在大脑中发挥其毒性作用的？特别是在新生儿期，当大脑的发育正处于一个极其脆弱和关键的阶段时，胆红素的影响尤为显著。
小薇师姐今天带来的这篇研究论文，由上海交通大学医学院附属第六人民医院耳鼻咽喉头颈外科殷善开/时海波教授深入探讨了胆红素如何精确地影响特定的神经细胞，以及这些影响如何可能导致听觉障碍。揭示了胆红素（Bilirubin）对新生儿大脑中GABAergic抑制性神经元的特异性毒性作用，尤其是通过HCN1通道的选择性激活。主要利用了遗传敲除（HCN1-/-）和药理阻断（ZD7288）手段，精确地探究了HCN1通道在胆红素诱导的神经毒性中的作用，并通过电生理学、免疫组织化学和动物行为测试等方法，全面评估了胆红素对听觉脑干的影响。思路清晰，设计严谨，数据可靠，并且通过构建动物模型，增强了研究的临床相关性。还是比较好复现的，朋友们抓紧实操起来吧！Ps：好复现也要确定首要的选题方向，才能顺利开赞！灵光乍现，但没有下文？没关系，你来提供idea，小薇师姐提供优质服务，主打就是一个满意！着急毕业/申请基金的小伙伴欢迎找小薇师姐聊聊。
定制生信分析
云服务器租赁
加微信备注99领取使用
题目：新生儿脑GABA能抑制性中间神经元对胆红素神经毒性的选择性易感性
杂志：J Neurosci
发表时间：2024年9月
研究背景
新生儿听力障碍常见，高胆红素血症（HB）是重要病因，尤其在早产儿中。胆红素（BIL）可在脑干沉积，影响多种神经功能。其神经毒性机制复杂，涉及多个信号通路，但对抑制性神经元的影响在新生儿阶段知之甚少。
研究思路
研究设计周密，首先通过体外实验验证胆红素对听觉脑干神经元的影响，然后通过构建小鼠模型来模拟高胆红素血症，最后通过听觉诱发反应（ABR）测试来评估慢性胆红素升高对成年小鼠听力的影响。这一路线不仅涵盖了从分子到整体的多个层面，还考虑了性别和遗传背景的影响，为研究提供了坚实的基础。
研究结果
咱们跟着作者的思路一步步剖析实验设计，首先要搞清楚关键的科学问题是什么？才能对应依次解决~
1.胆红素是否及如何通过HCN通道影响神经元死亡，哪种细胞类型更易受影响？
细胞死亡测定实验
对HCN1+/+和HCN1-/-新生小鼠脑干切片（100μm）的CN神经元，在三种条件下进行细胞死亡测定：①含突触阻断剂的ACSF作为对照；②含突触阻断剂加BIL（9μM）；③含突触阻断剂加BIL（9μM）和HCN通道非特异性抑制剂ZD7288（40μM）。通过Calcein-AM和PI双染色，分别计数活细胞和死细胞。
利用报告小鼠区分细胞类型
使用VGAT cre-tdTomato报告小鼠，其中所有GABAergic神经元被荧光标记。在BIL处理前后对CN切片进行Calcein-AM染色，观察标记细胞的活力变化。
分析单细胞转录组测序数据
重新分析单细胞转录组测序数据，研究HCN1和HCN2基因表达与抑制性和兴奋性神经元标志物的相关性。（处理数据电脑不给力咋办？别忘了小薇师姐有服务器可以助力！）
电生理特性鉴定
对td-tomato阳性细胞进行膜片钳记录，鉴定其电生理特性，确定是否符合Stellate细胞（SCs）特征，同时对比td-tomato阴性细胞的电生理特性。
免疫荧光染色定位
利用VGAT cre-td Tomato报告小鼠，通过免疫荧光染色定位HCN1和HCN2在CN中的位置，观察其与td-Tomato标记的神经元的共定位情况。
结果发现：体外实验表明，BIL增加PI标记的死亡细胞数，ZD7288可抑制；而在HCN1-/-小鼠中无此现象。VGAT cre-tdTomato报告小鼠，BIL降低Calcein-AM共染色的tdTomato阳性细胞活力，且HCN1在抑制性神经元中高表达，与抑制性神经元标志物共定位。
2.胆红素如何影响SCs的内在兴奋性和Ih幅度？
全细胞电压钳记录
使用基于的细胞内溶液，在HCN1+/+和HCN1-/-小鼠的CN切片中，通过全细胞电压钳记录在突触阻断剂存在下，Ih在SCs中的变化。在建立全细胞配置后，通过一系列超极化电压步骤诱发Ih，观察BIL对Ih幅度和激活时间常数的影响，以及对SCs去极化诱导放电次数的影响。
对比不同的细胞类型
根据电生理特征检查BIL对CN中其他细胞类型（如bushy、fusiform、cartwheel和tuberculoventral细胞）的Ih的影响。
结果发现：BIL增强HCN1+/+小鼠SCs的Ih电流，增加去极化诱导的放电次数，但对HCN1-/-小鼠SCs无影响。BIL对其他细胞类型的Ih无显著影响。
3.胆红素对HCN1和HCN2通道的作用是否具有特异性？
HEK-293T细胞系实验
在HEK-293T细胞系中瞬时转染人HCN1或HCN2通道，进行膜片钳记录。在HCN1或HCN2过表达后，观察-150mV下的Ih电流轨迹，对比BIL对两种通道介导的Ih的影响，包括幅度、激活曲线、最大Ih方向以及激活时间常数等方面的变化。
结果发现：BIL增加HCN1通道的Ih幅度，加速其激活；而降低HCN2通道的Ih幅度，使其激活减慢。
4.胆红素如何影响HCN1通道的膜靶向？
钙螯合实验
用BAPTA-AM预处理切片以螯合细胞内Ca²⁺，然后观察BIL对SCs中Ih的影响。
免疫印迹和共染色实验
使用膜和胞质蛋白提取试剂盒从CN切片中分离膜和胞质的HCN1和HCN2蛋白，进行免疫印迹分析，观察BIL处理后两种蛋白在膜和胞质中的分布变化。同时进行膜染料DID和HCN通道免疫荧光共染色实验，通过线扫描分析DID和HCN信号的荧光强度分布，确定HCN通道在细胞膜附近的水平变化。
结果发现：TAT-NSF700可阻止BIL诱导的Ih增加，BAPTA-AM螯合Ca²⁺也可阻断，而Dynasore无效。BIL增加HCN1在膜上的表达，降低其在胞质中的表达，而对HCN2作用相反。
5.慢性胆红素升高在体内对听力的影响及机制？
建立小鼠HB模型
通过腹腔注射BIL（100μg/g，连续7天，从出生后第3天开始）建立小鼠HB模型，对照组注射生理盐水。
电生理特性研究
在HB模型小鼠P10时，用非侵入性细胞贴附式配置在突触阻断剂存在下，研究CN神经元的基本电生理特性，包括内在放电情况、事件间隔、放电频率、Ih以及膜电位响应等。
细胞活力评估
用Calcein-AM和PI双染色评估HB小鼠切片中CN神经元的活力。
ABR测试
在小鼠达到>30天（P30-35）时，进行ABR测试，评估HB对听力功能的长期影响，分析ABR阈值、波形振幅和潜伏期等指标。
结果发现：HCN1+/+-HB小鼠的CN神经元内在兴奋性升高，Ih增大，死亡率增加；而HCN1-/--HB小鼠无明显变化。ABR测试显示，HCN1+/+-HB小鼠在32kHz和40kHz出现高频听力损失，ABR波形振幅降低、潜伏期延长；HCN1-/--HB小鼠无明显ABR阈值变化。
文章小结
①GABAergic抑制性中间神经元对HB诱导的毒性特别敏感，主要是表达HCN1的快放电SCs。BIL通过促进HCN1通道门控和钙依赖的膜靶向，增加Ih，导致神经元兴奋性增高和死亡。
②HB优先靶向HCN1损伤抑制性中间神经元，引发一系列反应，导致听力损伤。HCN1可作为治疗HB脑病的潜在靶点，且中间神经元对神经毒性的易感性对理解其他脑损伤形式有普遍意义。
这样一篇干湿结合文章，难度不大还是易复现的，对以往自测或者公开转录组数据再次分析，可能会有意外收获噢~充分利用自测数据挖掘多个选题，节省成本还多了产出，何乐而不为呢？想进一步完善课题设计和数据挖掘的朋友，找小薇师姐助力就ok啦！
小薇公众号持续为大家带来最新医学思路，更多创新性分析思路点击往期推荐。想复现这种思路或者定制更多创新性思路欢迎直接call小薇师姐，竭诚为您的科研助力！
扫码
咨询
小薇
生信分析
服务器租赁
往期 · 推荐
你的“细胞衰老”课题卷进国自然了吗？没中的看过来！安徽医科大学研究团队：单基因结合细胞衰老，抓住科研新风口，经典思路也不愁发文！
发现“分享”和“赞”了吗，戳我看看吧
