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1、这篇文章发表在《Cell Reports》，三大名刊CNS中《Cell》的子刊，是Cell Press出版社（Elsevier的子集团）2011年创建，2012年1月发表第一期的一本开放获取期刊。这项研究主要揭示了乳酸驱动的巨噬细胞功能通过抑制RARγ表达来重塑，并强调NDGA作为治疗CRC（结直肠癌）的候选化合物；

2、本文主要通过使用单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析研究了RARγ在人CRC组织中的免疫和基质群体中的表达，鉴定了RARγ表达显着低的TAM。此外，研究尚未探明RARγ是否参与调节其他炎症和免疫细胞的功能，为后续可能的研究提供了方向。（ps：如果小伙伴们也想要进行相关热点方向的课题设计评估和生信分析都可以扫码联系小薇师姐哦~小薇师姐随时在线给你最专业的解答！陪你一起打怪升级，早日拿到“”通关文牒！）

题目：组蛋白乳酸化通过激活TRAF6-IL-6-STAT3信号通路，抑制巨噬细胞中RARγ的表达，促进结直肠肿瘤的发生

杂志：Cell Reports

影响因子：IF=7.5

发表时间：2024年2月

研究背景

肿瘤相关巨噬细胞（TAM）在肿瘤微环境（TME）中构成了丰富、动态和异质的细胞群。促进肿瘤的TAM在几种类型的癌症中表现出不同的分子特征，包括结直肠癌（CRC）。最近的研究揭示了CRC肠上皮细胞中RARγ的下调与肿瘤进展过程中Yes相关转录调节因子（YAP）的功能增强有关。总之，已经证实了RARγ在肿瘤实质中的多效性作用。然而，它在肿瘤基质中的表达和功能，特别是它如何在CRC起始和进展中微调TME，尚不清楚。

研究思路    

研究结果

1.巨噬细胞中RARγ的下调与CRC患者的不良预后有关

为了揭示RARγ在CRC微环境中的临床重要性，首先通过分析从CRC肿瘤和邻近组织获得的scRNA-seq数据，研究了RARγ在不同细胞类型中的表达。结果显示，与其他髓系细胞相比，RARγ的表达最低。此外，与周围组织相比，在肿瘤组织中观察到巨噬细胞（CD68细胞）的浸润增加;然而，TAMs中RARγ细胞的比例非常低。基因集富集分析（GSEA）显示，RARγ缺乏使TAMs极化为前肿瘤状态，其特征是增加M2样巨噬细胞表型、巨噬细胞活化和增强巨噬细胞趋化性和迁移，这是炎症相关癌症的重要步骤。进一步进行了多重免疫荧光（MxIF）以检查代表104名CRC患者的组织微阵列中RARγ的表达。数据表明，在肿瘤组织中检测到大量浸润的巨噬细胞，但巨噬细胞具有更高比例的低RARγ表达细胞。此外，单因素和多因素Cox回归分析显示，巨噬细胞中RARγ的水平是CRC结果的独立预测因子，在104名CRC患者队列中具有显着的风险比。综上所述，这些临床数据有力地表明，巨噬细胞中RARγ的表达是结直肠癌预后的一个潜在预测因子。    

图1 RARγ在巨噬细胞中下调，预示着不良的临床结果

2.肿瘤衍生的乳酸通过组蛋白乳酸化抑制巨噬细胞RARγ基因转录

为了确定导致巨噬细胞中RARγ表达降低的潜在机制，使用基于Transwell的共培养系统将巨噬细胞与CRC细胞共培养。结果显示，当骨髓来源的巨噬细胞（BM-Mφs）和人单核细胞THP1细胞与CRC细胞共培养时，这些细胞中的RARγ mRNA水平受到强烈抑制。为了测试乳酸是否是导致巨噬细胞中RARγ表达降低的原因，研究者们在CRC细胞的培养基中加入糖酵解抑制剂2-脱氧葡萄糖（2-DG）以抑制乳酸的产生，并发现抑制CRC细胞中乳酸的产生大大上调了巨噬细胞RARγ的表达。一致地，乳酸脱氢酶LDHA基因的缺失部分抑制了MC38细胞中乳酸的产生，这显着增加了共培养系统中BM-Mφs中RARγ的表达。相反，在BM-Mφs的培养基中添加外源乳酸可显着抑制RARγ的表达。一致地，流式细胞术分析进一步证实，与对照组相比，来自LDHA耗尽肿瘤的巨噬细胞表现出降低的H3K18la水平和增加的RARγ表达。总的来说，这些发现表明，TME中积累的肿瘤衍生乳酸足以抑制RARγ基因从染色质到H3K18la的转录（图2N）。    

图2 H3K18乳酸化负责巨噬细胞中RARγ的下调

3.缺乏RARγ的单核细胞/巨噬细胞表现出增强的迁移能力并促进肿瘤生长

为了研究巨噬细胞RARγ对肿瘤发展的影响，首先使用基于慢病毒载体的方法生成了过表达RARγ（THP-1/OE/RARγ）的稳定THP1细胞系以及绿色荧光蛋白（GFP）的共表达。随后，在裸鼠中建立了皮下异种移植模型。肿瘤细胞接种后2天，通过尾静脉将THP-1 / OE / RARγ或THP1 /对照细胞静脉注射到小鼠中。结果表明，与对照组相比，THP1 / OE / RARγ处理的小鼠的体重减轻和体积较小证明THP1 / OE / RARγ处理的小鼠的过表达显着抑制肿瘤生长。流式细胞术分析进一步证实，源自THP1/OE/RARγ处理的小鼠的肿瘤具有减少的浸润 GFP THP1 细胞群。与这些结果一致，体外Transwell细胞迁移试验表明，在THP1细胞中过表达RARγ显着降低了THP1细胞对肿瘤细胞的趋化性，而THP1细胞中RARγ的消耗大大增强了它们对肿瘤细胞的趋化性，表明RARγ在单核细胞/巨噬细胞中的耗竭促进了它们向肿瘤组织的迁移能力。此外，RARγ在THP1细胞中的过表达显着抑制了CSF-1R表达，而THP1细胞中RARγ的沉默大大增强了CSF-1R表达。有趣的是，使用CSF-1R特异性抗体阻断CSF-1R功能显著损害了THP1细胞的迁移能力，表明CSF-1R介导单核细胞/巨噬细胞迁移。    

图3 单核细胞/巨噬细胞RARγ调节其迁移能力并介导CRC肿瘤生长

4.巨噬细胞中RARγ的耗竭激活CRC细胞中的STAT3信号传导

最初，从稳定表达对照shRNA的THP1细胞（shRNA/对照）中收集条件培养基（CM0），从具有稳定RARγ沉默的THP1细胞中收集条件培养基（CM1或CM2），然后培养CRC细胞。结果显示，与CM0相比，CM1或CM2处理后CRC细胞中磷酸化的STAT3（pSTAT3）水平显着升高。一致地，免疫荧光（IF）染色显示，用条件培养基CM1处理CRC细胞可极大地促进STAT3核易位。进一步研究了STAT3的转录活性和靶基因表达。结果表明，CM1和CM2显着增加了STAT3介导的报告基因活性，而CMR条件培养基发挥了相反的效果。Spearma秩相关分析证实，巨噬细胞中RARγ的表达与肿瘤细胞中pSTAT3的表达之间存在显著的负相关。总的来说，这些结果表明，巨噬细胞中RARγ的消耗会激活STAT3信号传导，从而促进TME中的肿瘤生长。与这些结果一致，CM2显着促进了从新鲜人结肠癌组织中分离的肿瘤类器官的形成，而IL-6中和抗体极大地抑制了肿瘤类器官。免疫荧光数据表明，IL-6中和抗体处理减弱了CM2在肿瘤类器官中诱导的STAT3的核定位。总之，这些结果表明IL-6在激活STAT3和类器官形成中发挥作用。    

图4 巨噬细胞中的RARγ缺乏激活CRC细胞和人CRC肿瘤类器官中的STAT3信号传导

5.巨噬细胞中RARγ敲低激活NF-κB信号是CRC细胞和类器官中STAT3激活所必需的

免疫共沉淀（CoIP）分析显示，内源性和外源性RARγ都与TRAF6相互作用。一致地，重组GST-TRAF6而不是GST直接与Strep-RARγ/LBD结合，表明RARγ和TRAF6之间存在直接相互作用。此外，研究者们对RARγ和TRAF6之间的相互作用进行了计算建模，结果表明RARγ-TRAF6复合物可以通过RARγ的LBD结构域和TRAF6的TRAF-N结构域相互作用。RARγ的LBD结构域中的残基P320–D324负责其与TRAF6的相互作用。重要的是，丙氨酸扫描显示，用丙氨酸替换322位的谷氨酸残基极大地损害了复合物的稳定性，表明RARγLBD区域的E322残基是其结合TRAF6的能力所必需的CoIP测定进一步证实，突变体RARγ/E322A失去了结合TRAF6的能力，并且未能在细胞中与TRAF6共定位。此外，RARγ的过表达以剂量依赖性方式极大地抑制LPS诱导的TRAF6自身泛素化。相比之下，RARγ的沉默进一步增强了LPS诱导的TRAF6自身泛素化。总的来说，这些结果表明，RARγ与TRAF6相互作用，抑制巨噬细胞中的NF-κB激活和IL-6的产生，从而减弱肿瘤细胞中的STAT3信号传导。    

图5 RARγ与巨噬细胞中的TRAF6相互作用

6.NDGA直接与RARγ结合，抑制TRAF6-IL-6-STAT3信号传导并抑制CRC生长

采用基于结构的分层虚拟筛选方法从天然和生物活性化合物库中筛选潜在的RARγ配体，最终发现NDGA是一种从Larrea tridentata获得的酚类木脂素，以剂量依赖性方式直接与RARγ结合。因此，NDGA剂量依赖性地抑制由ATRA诱导的Gal4-DBD-RARγ-LBD反式激活，ATRA是RARγ的经典配体。此外，细胞热位移测定（CETSA）显示，与DMSO相比，NDGA提高了RARγ的热稳定性。这些结果表明NDGA直接与RARγ结合。NDGA和相互作用残基的演化时间表明，在剩余的MD模拟中，NDGA与A302、G303、R396和E403之间的氢键稳定了复合构象。NDGA的强效抗肿瘤作用与IL-6-STAT3信号传导的抑制有关，如在小鼠中施用NDGA显着降低血清中TNFα和IL-6的水平并显着抑制肠道肿瘤组织中STAT3磷酸化。从机制上讲，NDGA促进了RARγ与TRAF6的相互作用，并抑制了巨噬细胞中TRAF6的寡聚化和自泛素化。综上所述，这些结果表明，NDGA靶向巨噬细胞RARγ通过抑制TME中的TRAF6-IL-6-STAT3信号传导发挥抗肿瘤作用。    

图6 NDGA通过靶向RARγ 抑制TRAF6-IL-6-STAT3信号传导以抑制肿瘤生长

文章小结

本研究的创新性主要在于通过scRNA-seq成功“打开”CRC细胞中的致癌STAT3信号传导；使用基于结构的药效团模型鉴定了一种天然和生物活性化合物库中的潜在RARγ配体NDGA，它对肿瘤生长表现出有效的抑制作用。总之，这项研究强调了乳酸化驱动的RARγ下调对巨噬细胞促炎和促肿瘤表型的重要性，并揭示了一种以前未被发现的机制，负责在TME中激活TRAF6-IL-6-STAT3信号传导。此外还确定了NDGA 是一种很有前途的靶向RARγ的抗肿瘤药物，用于治疗炎症相关CRC。亲爱的小伙伴们，如果你也对相关的研究热点和思路感兴趣，快来扫码联系小薇师姐吧！你们的科研道路上怎么能少得了小薇师姐呢？小薇师姐愿做你们的“天命人”，与你们一起“斩妖除魔”！  

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