嘿！各位科研小伙伴们，我们又见面了！提到中药，大家第一个想到的是哪味中药呢？小薇师姐首先想到的就是红参！红参药理作用十分广泛，如抗炎抗肿瘤等，而这些作用都离不开它的主要成分——人参皂苷-Rh2 (GRh2)。今天小薇师姐就给大家分享一篇有关GRh2研究的宝藏文章，不仅思路清晰、内容丰富，而且容易复现，快来记笔记！
这是一篇由温州医科大学肖健团队今年7月发表在Journal of agricultural and food chemistry期刊上的文章。本文不仅以中药有效成分GRh2为出发点，还结合了自噬和细胞焦亡的研究热点，并通过网络药理学、分子对接和多组学分析的方法全面揭示了GRh2对改善脊髓损伤（SCI）后神经功能的分子机制，为SCI的治疗提供了新视角。
1.本研究揭示了GRh2能够显著促进SCI小鼠的功能恢复，表明GRh2可能作为一种改善SCI后神经功能的潜在的治疗手段。
2.文章深入探究了GRh2对自噬相关蛋白和细胞焦亡标志物的影响，证明了GRh2能够通过激活TFEB来增强自噬，抑制细胞焦亡。
3.本文揭示了GRh2可能通过EGFR-MAPK信号通路激活TFEB，发挥神经保护作用。为理解GRh2的作用机制和新药开发提供了新思路。
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题目：人参皂苷-Rh2通过增强TFEB介导的自噬促进脊髓损伤后的功能恢复
期刊：Journal of agricultural and food chemistry
影响因子：5.7
发表日期：2024年7月
公众号回复“123”领取原文PDF，文献编号：20241030
研究背景
自噬在脊髓损伤（SCI）后神经元保护中发挥积极作用，而焦亡则引发炎症反应。人参皂苷-Rh2 (GRh2)以其神经保护作用而闻名，被认为是一种有前途的药物。然而，这些保护作用的分子机制尚不清楚。本研究主要探讨了GRh2在SCI中的治疗价值及其潜在作用机制。
研究思路
本研究对SCI小鼠模型进行随机分组并在不同条件下进行药物治疗利用HE染色、Masson染色、尼氏染色、足迹分析、BMS评分和斜面测试全面评估GRh2治疗后SCI小鼠的功能恢复情况，之后利用WB、免疫荧光、qPCR检测小鼠体内相关指标的表达水平，最后通过网络药理学分析确定GRh2发挥治疗作用的相关信号通路。
主要结果
1.GRh2促进SCI后功能恢复
为了探究GRh2是否会促进SCI后功能恢复，研究者将小鼠分为Sham组（无SCI损伤）和Sham+GRh2组（无SCI损伤，GRh2治疗），并对SCI后脊髓的病变区域进行HE和Masson染色分析，分析结果表明SCI组胶质疤痕面积明显大于Sham组，而SCI+GRh2组病变面积明显小于SCI组（SCI损伤）（图1A、B）。观察发现接受SCI+GRh2组（SCI损伤，GRh2治疗）小鼠表现出MAP2表达水平升高和SYN阳性突触计数更高（图1C-F），SCI 组的前角神经元数量显著低于Sham组和SCI + GRh2组（图1G−H）。GRh2在小鼠运动功能恢复中的BMS评分、斜面测试和足迹分析结果表明，SCI组的BMS评分和斜面角度显著低于Sham组，而GRh2治疗组的BMS评分和斜面角度显着高于Sham组，在第14天、第21天和第28天时斜面角度比SCI组大（图1I、L）。
图1 GRh2可促进SCI后的功能恢复
2.GRh2增强SCI后自噬
研究者通过自噬相关标志物的表达来评估GRh2对SCI后小鼠自噬活性对底物蛋白 (p62)、自噬体标志物 (Beclin-1、ATG5 和 LC3) 和溶酶体 CTSD的影响。WB分析表明，在SCI后第三天，小鼠中Beclin-1、ATG5、LC3II和CTSD蛋白表达水平高于Sham组，经GRh2处理的SCI小鼠中表达水平更高，而SCI+GRh2组自噬底物p62蛋白表达水平低于SCI组（图2A、B）。p62和LC3的荧光图像结果显示，SCI组神经元中p62的荧光强度显着增加，而SCI+GRh2组的荧光强度相对较低。IF染色结果发现小鼠在SCI后表现出LC3数量随着GRh2 治疗而增加（图2C-E）。研究使用巴弗洛霉素A1阻断自噬体和溶酶体之间的相互作用以验证SCI和GRh2对自噬流的影响，研究结果表明SCI + GRh2 + BafA-1组中p62和LC3II的表达水平显着高于SCI+GRh2组（图2F、G）。
图2 GRh2增强SCI后的自噬
3.GRh2抑制SCI后细胞焦亡
研究通过WB和IF染色分析GRh2是否在抑制细胞凋亡中发挥作用并评估SCI后的焦亡活性。WB分析结果显示有7种细胞焦亡相关蛋白在SCI中表达较高（图3A、B）。对SCI后小鼠神经元中NLRP3和GSDMD-N的免疫荧光检测结果表明与SCI组相比，SCI + GRh2组的焦亡表达水平在神经元的整合密度和阳性小胶质细胞的数量方面均显著降低（图3C-H）。
图3 GRh2抑制SCI后的焦亡
4.GRh2通过上调SCI后自噬抑制细胞焦亡
研究者通过GRh2和3-MA联合给药的方式对SCI后自噬和细胞焦亡之间的关系进一步分析。各组小鼠中p62、Beclin-1、ATG5、CTSD和LC3II蛋白表达水平的WB分析结果显示，与SCI+GRh2+3-MA组相比，SCI+GRh2组p62蛋白表达量较低，其余蛋白表达量较高（图4A、B）。这一结果也在IF染色中得到了验证，IF染色结果显示，SCI+GRh2组神经元中p62的荧光强度弱于SCI+GRh2+3-MA组，而神经元中LC3染色斑点的数量显著高于SCI+GRh2+3-MA 组（图4C-E）。此外，研究发现3-MA可以部分逆转GRh2对SCI后细胞焦亡的抑制作用，WB分析表明焦亡相关蛋白的表达水平显着高于对照组，SCI+GRh2+3-MA组优于SCI+GRh2组（图4F、G）。同时，免疫荧光共定位分析显示，与SCI + GRh2组相比，SCI + GRh2 + 3-MA组神经元中NLRP3和GSDMD-N的密度显著增加（图4H−J）。
图4 GRh2通过上调SCI后的自噬来抑制焦亡
5.GRh2通过促进TFEB的核转位增强SCI后的自噬并抑制细胞焦亡
为探究GRh2对SCI后小鼠TFEB核转位的影响，研究者对Sham、SCI和SCI+GRh2的组织切片进行了荧光染色，结果观察到TFEB在细胞质和细胞核中的表达显著增加（图5A-D）。qPCR和WB分析结果显示在Sham + Scramble、SCI + Scramble和SCI + GRh2 + Scramble组中，TFEB mRNA、细胞质TFEB、细胞核TFEB和p-TFEB的蛋白表达水平均逐渐升高。然而与 Sham + TFEB shRNA、SCI + TFEB shRNA 和 SCI + GRh2 + TFEB shRNA 组进行比较时，发现上述蛋白表达水平降低（图5E-G）。此外，IF染色也显示SCI + GRh2 + Scramble组神经元中TFEB的荧光强度始终高于SCI + GRh2 + TFEB shRNA组（图5H-L）。
图5 GRh2通过增强TFEB的活性促进核易位
为进一步探究GRh2诱导的TFEB核转位调节SCI后小鼠脊髓的自噬活性和细胞焦亡，在SCI后第3天进行了WB分析，结果显示SCI+GRh2+Scramble组中Beclin-1、ATG5、LC3II、CTSD表达量显著高于SCI+Scramble组,而p62表达量降低。与 SCI + GRh2 + TFEB shRNA 组相比，SCI + GRh2 + Scramble组中Beclin-1、ATG5、LC3II 和 CTSD 显着增加，p62减少（图6A、B）。免疫荧光染色也表明与SCI +GRh2+ Scramble shRNA 组相比，SCI + GRh2 + TFEB shRNA组神经元中LC3数量显著降低，但p62荧光强度较高（图6E−G）。此外，研究发现当在TFEB被敲低后，GRh2促进自噬和抑制细胞焦亡的作用被逆转。WB分析发现与SCI + Scramble组相比，SCI + GRh2 + Scramble组焦亡相关蛋白的表达较低，但SCI + GRh2 + TFEB shRNA组焦亡相关蛋白的表达增加（图6C、D），这一发现也在免疫荧光染色中得到了验证（图6H-J）。
图6 GRh2通过上调TFEB的表达水平促进自噬和抑制焦亡
6.GRh2通过EGFR-MAPK信号通路激活TFEB
为了探究GRh2激活发挥神经保护作用的途径，研究者通过数据库获得的97个公共靶点构建了维恩图和PPI网络图（图7A、B）。GO分析共产生了生物过程、细胞成分和分子功能三个子类别。同时，KEGG分析共确定了138 个通路的富集，其中排名前15的KEGG通路，主要涉及PI3K-Akt、MAPK、Ras、Rap1、FoxO和催乳素信号通路（图7C、D）。研究者通过构建化合物靶标-通路相互作用网络图对GRh2 在 SCI 治疗中的特征进行了更直观的分析，并揭示了按程度值排序的前五个常见靶点：EGFR、SRC、ALB、CASP3和AKT1（图7E、F）。
图7 GRh2的网络药理学分析和分子对接
研究者假设GRh2通过EGFR-MAPK信号通路发挥作用并对其进行了验证，研究结果表明在NSC的作用下，与SCI+GRh2组相比，SCI+GRh2+NSC组p-EGFR、pERK、p-JNK、p-p38的表达水平显著升高，TFEB核转位和去磷酸化显著减少（图 8A、B)。荧光染色结果也显示 SCI + GRh2 组的荧光强度显着低于 SCI + GRh2 + NSC 组（图 8E、F）。通过对EGFR-MAPK信号通路参与 GRh2介导的自噬和细胞焦亡调节的研究结果表明，与SCI+GRh2组相比，SCI+GRh2+NSC组中自噬底物p62和细胞焦亡相关蛋白的表达水平显著上调，而Beclin-1、ATG5、LC3II、CTSD下调（图8C、D）。
图8 GRh2通过EGFR-MAPK信号通路激活TFEB
文章小结
本研究揭示了GRh2可以通过上调TFEB介导的自噬流和抑制细胞焦亡改善SCI后的功能恢复，证明了GRh2潜在的临床适用性。中医药、自噬和细胞焦亡多个热门研究方向结合，在加上网络药理学和分子对接的加持，更是能为文章锦上添花。本文中的实验内容多为基础实验，因此想要复现这篇文章还是比较容易的，对这篇文章思路感兴趣的小伙伴们快来联系小薇师姐吧，方案设计、项目评估有我不愁！此外，如果有想做更深入生信分析的小伙伴，这里还提供服务器租赁服务，新朋友可以免费试用哦~
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