一、背景介绍
细胞污染是细胞培养中老生常谈的话题。常见的污染源包括细菌、真菌、支原体、黑胶虫等，受污染的细胞往往会导致其形态发生改变、生长速度缓慢，严重时甚至造成细胞死亡，费时又费力，严重影响实验进度。一般情况下，细胞污染不能被完全清除，所以我们需要严格把控实验操作流程，以尽可能避免或减少细胞污染给实验造成的不良后果。本文就如何判断细胞培养中常见的几种污染物以及如何防治污染作一简要介绍。
二、细胞培养中常见的几种污染
1.细菌污染
细菌污染是最为常见的一种污染类型。其形态较为规则，通常呈球状或杆状，分布也比较均匀，镜下观察有定向运动；增殖速度极快，并伴随有大量酸性物质产生，因此，受细菌污染的培养基通常会变浑浊，并由红色变为黄色，比较好辨别。受细菌污染的细胞镜下观察发现其胞质中会出现大量颗粒物，并且细胞的生长速度缓慢，形态逐渐变圆直至死亡，如若不及时处理，细胞基本会全军覆没。（注：切不可认为所有的培养基变黄都是由细菌污染造成的，在细胞生长良好的情况下如不及时更换培养基，培养基中的营养物质被细胞逐渐消耗，培养基颜色也会逐渐变黄，所以还要注意观察细胞的生长状况哦，这一点需要区分）。
2.真菌污染
实验室常见的真菌污染主要包括念珠菌、酵母菌和霉菌污染三大类。真菌污染后，在感染初期培养基基本无太大变化，所以不易察觉。真菌污染后通常会有肉眼可见的菌落形成，在显微镜下呈现丝状、管状、树枝状或链球状，纵横交错，比较容易区分。其中，霉菌污染相对而言比较好辨别，细胞受到霉菌污染后，培养基中通常会出现絮状物，而其他大部分真菌污染后培养基仍然是清亮的。真菌污染一般情况下对其周围局部细胞影响较大，而其他地方的细胞则正常生长，但一旦发生污染，比较容易扩散。
3.支原体污染
支原体污染在细胞培养中发生率较高的污染类型，由于支原体是目前已知的最小的原核生物，所以在显微镜下无法观察到。细胞受支原体污染后，培养基无明显变化，但细胞的生长速度会明显减慢，细胞状态明显受到影响，会产生很多细小的碎片，细胞的形态也会发生变化，细胞间会出现“拉丝”现象。
4.黑胶虫污染
黑胶虫污染是比较好辨别的。通常情况下，细胞受黑胶虫污染后经过显微镜观察会发现镜下在细胞周围和培养基中会出现大量“小黑点”，且在不停运动，通过换液和洗涤也无法将其清除。受黑胶虫污染后，培养基染色一般不会发生改变，但细胞生长缓慢，有时甚至出现空泡，细胞状态明显变差。
补充知识之细胞培养中的“小黑点”
通过上述内容的概述，我们就可以初步对细胞污染的几种类型加以区分。那在细胞培养中，“小黑点”通常也是高频词汇，但需要注意的是并不是一出现“小黑点”就认为细胞被污染了哦！除微生物污染外，在正常情况下也有可能出现“小黑点”，常见于以下几种情况：
1.如果细胞传代次数过多，细胞活力下降，那么就会出现很多“小黑点”，通常为一些细胞碎片或细胞分泌物，采用PBS清洗2-3次后就会完全消除，继续培养仍会出现，但不会影响细胞的生长；
2.在细胞培养中，强烈的物理刺激（最常见于消化贴壁细胞时，部分同学等不及消化就直接通过拍打培养瓶把细胞震下来，最好不要这样哦，可以将培养瓶置于37℃恒温箱中片刻加速消化，没有恒温箱的时候可以借助掌心的温度辅助消化，细胞会自动脱落下来）会导致部分细胞死亡，从而产生细胞碎片，镜下显示为“小黑点”；
3.血清中的沉淀：如磷酸钙；
4.如果细胞的培养环境改变就有可能会诱导细胞凋亡，从而出现凋亡小体，所以最好不要频繁更换细胞培养所用到的各种试剂。因此，在判断细胞是否污染以及污染类型时一定要将细胞生长状况、细胞形态、培养基变化、镜下观等结合起来综合判断。
图2 正常悬浮细胞
（左图：传代多次后出现明显“小黑点”，右图：PBS清洗3次后“小黑点”消失）
三、细胞培养中的污染防治
1．总述
首先需要重点强调的一点是，细胞污染一旦发生就很难彻底清除。即便现在市面上有很多的清除剂，但效果一般，在污染较轻的时候挽救一下还是可以的，而且倘若受污染的细胞状态发生改变也有可能对最终实验结果产生影响，即便挽救成功实验结果也是不可靠的。所以还是建议大家如果不是特别珍贵的细胞，最好在受到污染后直接丢弃，一方面避免影响实验结果耽误实验进度，另一方面以免影响到其他正常细胞的培养。因此，细胞污染重点在“防”，而非“治”。
2．如何预防细胞污染
1)实验前后均需对实验环境进行清洁，除用消毒试剂进行擦拭外，还需用紫外灯进行照射；
2)尽量避免将外界环境中的微生物带入实验室，因此在进入实验室之前，换用干净的实验服、鞋子、口罩、帽子等，如有风淋装置在进入实验室前最好进行风淋；
3)提前准备好细胞实验操作所用到的所有的实验试剂及耗材，用酒精棉球擦拭物品表面后再将其放入生物安全柜中进行紫外灯照射，物品在生物安全柜中的摆放严格按照清洁区-半污染区-污染区的顺序执行，以防交叉污染；
4)细胞实验所用到的实验试剂和耗材最好严格密封，尽量避免长期暴露在空气中，且在开封时最好的生物安全柜中进行；
5)取放细胞时，不仅要对培养瓶表面进行消毒，还需对手部、培养箱外表面进行消毒，且每次手在进出生物安全时必须消毒；
6)绝大部分实验室没有独立的细胞房，需要借助公共平台的，因此，在取放细胞时，还需要注意培养箱中其他细胞的培养状态，如有异常，及时转移细胞，以免受到污染。发现污染细胞及时告知本人或报告实验室管理人员，并需要彻底清洁培养箱；
7)复苏细胞时，一定要注意不可使水没过瓶口，并需对冻存管表面进行消毒后再拿进生物安全柜处理；
8)在生物安全柜中进行操作时，最好不要从试剂或培养瓶瓶口上方经过，以免带入微生物，瓶盖的放置可以朝上，操作不要经过其上方即可。也有部分同学习惯朝下放置，生物安全柜在实验开始前是经过清洁的，所以这个影响不大，视个人习惯而定；
9)如果在生物安全柜中处理过污染的细胞，那么最好彻底清洁生物安全柜，并紫外30min，结束后再进行其他细胞的处理；
10)一旦发现细胞污染，如细胞不是特别珍贵最好直接将其丢弃，并彻底清洁操作环境，以免污染正常细胞。
本文作者是"夏沫梦鸢"同学，在获得授权后，实验老司机将本文发表于公众号。
文稿：夏沫梦鸢
校对：煲仔饭
参考资料：
https://images.app.goo.gl/4M9snSR9dx8o1NVr9
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