中科院昆明动物研究所郑萍组 | 树鼩精原干细胞的转基因操作
学术
科学
2024-11-09 09:03
北京
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Bio-101是Bio-protocol旗下的中文生命科学实验方案共享平台。通过与四百多个国内优秀课题组合作，以及上千名专家的共同努力，平台已出版九本高质量、同行评审、开放获取的中文实验方案电子手册，促进了中国科研人员之间的交流与合作。每周末，小bio将选出一些文章与大家分享，本次我们选择的是中国昆明动物研究所遗传资源与进化国家重点实验室郑萍团队的题为“树鼩精原干细胞的转基因操作”的方法文章。
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精原干细胞在适当的体外培养条件下可进行自我更新和增殖，并可进行基因修饰，移植到受体动物睾丸曲细精管后可以存活，并通过再生持续产生精子。因此，精原干细胞是一种极富潜力的转基因细胞载体。我们前期在树鼩精原干细胞中成功建立了高效稳定的转基因操作技术体系，并产生了国际首例转基因树鼩。本实验方案对树鼩精原干细胞转基因操作的具体流程进行了描述，得到的转基因精原干细胞株，可直接移植到受体树鼩睾丸中用于生产转基因树鼩后代。关键词：树鼩 精原干细胞 转基因
1. 0.45 μm滤器（PALL, catalog number: 4654）3. 15 ml离心管（NEST, catalog number: 601052）4. 50 ml离心管（NEST, catalog number: 602001）5. 24孔板（Corning, catalog number: 3524）6. 培养皿（100 mm）（Corning, catalog number: 430167）病毒载体和包装载体：GAE-CAG-eGFP/WPRE、SIV3+、G-REV来自Wianny et al., 20089. Lipofectamine 3000（Thermo Fisher, catalog number: L3000015）10. 病毒浓缩试剂盒（Biomiga, catalog number: V2001-01）11. PBS（Hyclone, catalog number: SH30256.01B）12. Polybrene（SIGMA, catalog number: 107689）13. DMEM培养基（Thermo Fisher, catalog number: C11995500BT）14. 胎牛血清FBS（Thermo Fisher, catalog number: 10099141）15. 胰酶（Thermo Fisher, catalog number: 25200072）16. 5 mg/ml polybrene（见溶液配方）前期对适合用于树鼩精原干细胞转基因的病毒载体进行探索和优化，发现基于猴免疫缺陷病毒的SIV载体（GAECAG-eGFP/WPRE）构建的病毒对于树鼩精原干细胞具有较高的感染效率（班文赞，2016）。转染前24 h，将对数生长期的HEK293T 细胞传至10 cm细胞培养皿，过夜培养。 当细胞长至70-80%，用Lipofectamine 3000将携带目的基因的CAE-CAG-eGFP/WPRE载体和包装载体（SIV3和G-REV）根据以下比例进行转染（CAE-CAG-eGFP/WPRE : SIV3+ : G-REV = 1.3:1:1），转染质粒总量为12.5 μg。转染后48小时，收集细胞培养基上清，以0.45 μM 滤器过滤上清；用Biomiga病毒浓缩试剂盒根据说明书进行浓缩。将293T细胞传至24孔板中的10个孔。取10 μl浓缩好的病毒，加到1 ml细胞培养基中，得到10-2浓度的病毒培养液，并将其以10倍的比例倍比稀释，依次得到10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8浓度的培养基各1 ml。将24孔板中的培养基换成不同浓度的病毒培养液。24小时后，在荧光显微镜下观察细胞的病毒感染情况，选取GFP阳性细胞数量为10个左右的孔，如果该孔的病毒浓度是10-7，那么我们包装的病毒的滴度大概为：10/10-7 = 108 TU/ml。精原干细胞的生长周期一般是7天，准备一个24孔板的传代后5天左右的精原干细胞，用PBS重悬，转移至15 ml离心管，用细胞计数器计数，细胞总数在3x106-5 x106个。1 ml 精原干细胞培养基 +1 μl Polybrene（5 mg/ml） + 100 μl浓缩的病毒（108 TU/ml）。将细胞161 × g 离心5 min，弃去上清，吸取配制好的病毒孵育液重悬细胞，置于培养箱中悬浮感染24小时。病毒感染24小时后，161 × g 离心5 min，弃去病毒孵育液，将细胞用6 ml精原干细胞培养基重悬，接种到提前制备好的饲养层细胞上（24孔板的12个孔，关于饲养层细胞的制备，详见研究方案“树鼩精原干细胞系的分离和建系培养”）。隔天换液培养。3.1 病毒感染后48小时，可以通过荧光显微镜看到发绿色荧光的精原干细胞集落；3.2 通过流式细胞仪，分选出绿色荧光阳性的细胞，继续传代扩增培养。 注：以上实验过程中，涉及到使用病毒转基因工具，因此所有操作均应在生物安全柜中进行，并佩戴一次性口罩和手套。每次实验后，立即清理所有接触过病毒的器具，高压灭菌以后再进行下一步处理。显微镜和生物安全柜台面等使用后，用70%乙醇擦拭，并紫外照射消毒。流式分选过程容易导致精原干细胞污染，因此需要多加注意。也可用挑取单克隆的方式富集转基因阳性的精原干细胞。用分析天平称取5 mg的polybrene，用1 ml的PBS溶解，分装冻存于-20 °C。相关工作得到了中国科学院（XDB13000000和XDA01010203）、云南省 （2015HA038）、NSFC-云南联合基金项目（U1702284）以及昆明动物所“135”项目资助。利用本研究相似的方案，我们建立了GFP转基因树鼩，相关工作于2017年发表于《Cell Research》（Li et al., 2017）。前期班文赞、李朝晖等系统探索了不同病毒载体在精原干细胞中的转基因效率，为本实验方案提供了非常有价值的参考（班文赞，2016）。1. 班文赞. (2016). 树鼩精原干细胞转基因载体的构建. 昆明理工大学硕士学位论文.2. Li, C. H., Yan, L. Z., Ban, W. Z., Tu, Q., Wu, Y., Wang, L., Bi, R., Ji, S., Ma, Y. H., Nie, W. H., Lv, L. B., Yao, Y. G., Zhao, X. D. and Zheng, P. (2017). Long-term propagation of tree shrew spermatogonial stem cells in culture and successful generation of transgenic offspring. Cell Res27(2): 241-252.3. Wianny, F., Bernat, A., Huissoud, C., Marcy, G., Markossian, S., Cortay, V., Giroud, P., Leviel, V., Kennedy, H., Savatier, P. and Dehay, C. (2008). Derivation and cloning of a novel rhesus embryonic stem cell line stably expressing tau-green fluorescent protein. Stem Cells 26(6): 1444-1453.毕蕊, 李聪, 郑全振, 李余, 郑萍. (2021). 树鼩精原干细胞的转基因操作. // 实验动物胚胎操作实验手册. Bio-101: e1010934. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010934.
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