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您提的RNA质检合格吗？您还在为组内重复性差而苦恼吗？你还在面对极少的差异基因而不知所措吗？您还在为杂菌污染而感到疑惑吗？本文将为您介绍几个优化转录组取样的实用技巧，帮助您在研究中取得更加精确可靠的数据，尽量减少以上问题的出现。
转录组测序取样基本准则
1. 明确研究目的
首先，明确您的研究目标至关重要，组间选择就要通过预实验选择表型差异更大的组，确保您的研究设计能够获得更多的差异基因可以直接回答科学问题。
2. 生物学重复的重要性
建议每组实验至少包含三个生物学重复的样本（临床样品一般10个以上生物学重复），生物学重复选择生长状态表型一致的样本，同一时间取样减少误差。
3. 样本处理与保存
由于RNA极易降解且易受到Rnase的影响，因此在采集样本之后，需快速且一致地处理样本（用RNase-free水清洗样品表面或在冰上分离组织等），擦干样本表面的水分后，立即置于液氮中速冻15 min以上，-80℃超低温保存，干冰运输，以避免RNA的降解。
取样注意事项
1.取样时，应根据需求分离目标组织并预留备份，每份样品建议按照送样量要求提供，不宜提供过多的样品，避免样品过多导致的提取质量下降。
2. 对于多组学研究，建议从同一原始样本中取出多份，分别置于不同管中，以确保样本一致性，减少实验误差。
各转录组测序技术送样量要求
各种样本具体收集方法
1. 动物组织样本
1) 取新鲜组织，组织体积要小，尽量长宽高≤0.5cm ，所切组织块的大小可参考绿豆颗粒的大小；
2) 去除非研究的组织类型 (如结缔组织，脂肪组织等) ，如果是临床病变组织，要正确判断病变以及正常组织，将病变组织周围的正常组织去除干净，反之亦然；
3) 迅速用 2-6℃预冷 RNase-Free 水配制的 1 ×PBS 或生理盐水清洗组织表面的血迹和污渍，使用无尘纸巾吸干表面的液体；
4) 处理好的组织迅速放入预冷好的已写好样本信息的 RNase-Free 的带螺纹口的耐超低温冻存管或锡箔纸中，直接液氮速冻15 min以上，放入-80 ℃冰箱中保存；
5) 足量干冰运输，在RNA提取前避免样本反复冻融。
2. 动物细胞样本
1) 悬浮细胞：收集用PBS缓冲液快速洗一次，每5×106个细胞加入1 ml TRIzol试剂，用一次性注射器进行反复抽打细胞直至看不见成团的细胞块，整个溶液呈清亮而不粘稠的状态；放入-80 ℃冰箱中保存。
2) 贴壁细胞：用PBS缓冲液快速洗一次；按每10 cm2培养面积（相当于六孔板一个孔或35 mm直径培养皿）加1 ml TRIzol试剂的比例加入TRIzol试剂；用1 ml枪头反复吹打，使TRIzol接触所有长有细胞的培养瓶表面，并进行充分消化；转移到RNase-free的1.5 ml或2 ml的离心管中，用一次性注射器进行反复抽打细胞直至看不见成团的细胞块，整个溶液呈清亮而不粘稠的状态，放入-80 ℃冰箱中保存。
3）也可将细胞样本收集到离心管之后，去掉培养基，用PBS缓冲液快速清洗一次，然后离心去掉上清，不加TRIzol裂解液，直接液氮速冻15 min以上，放入-80 ℃冰箱中保存。
4） 细胞样品不要保存于RNAlater一类组织RNA保护试剂中送样，因为RNAlater密度较大，保存于RNAlater中的细胞难于再离心收集用于提取，损失大。
5）寄送时将样本管放入更大的管或者自封袋中，防止样本运输过程中被破坏，并用足量干冰运输。
3. 植物组织样本
较老组织RNA含量低，次生代谢物含量相对较高，所以尽量选择健康、幼嫩的新鲜组织样本，采样流程如下：
1) 用Rnase free水将样本表面的杂质冲洗干净，吸水纸蘸干，再取新鲜组织；
注：如果是活体取样，尽量在活体上进行前处理后再取样。
2) 如果组织体积较大，将组织剪切成小块；
3) 处理好的组织放入预冷好的已写好样本信息的 RNase-Free 的带螺纹口的耐超低温冻存管或锡箔纸中，直接液氮速冻15 min以上，放入-80 ℃冰箱中保存；
4) 足量干冰运输，在RNA提取前避免样本反复冻融。
注意事项：
1) 优先选用新鲜采集的样品活株送样，新鲜，幼嫩，特别是林木类的物种更加要新鲜幼嫩；
2) 不要直接将叶片组织放在自封袋；
3) 做好预处理，要分管送，避免处理的时候反复冻融。
4. 血液样本
新鲜血液样本
1) 抗凝管选择紫头K2EDTA、Na2EDTA 抗凝管（不建议使用肝素、柠檬酸钠），做好名称标记；
2) 采集一定量血液后颠倒缓慢混匀十次左右，使抗凝剂和血液充分混合，转入4℃保存；
3) 将采血管用防撞泡沫包起来，使用橡皮筋捆绑严实，置于泡沫箱；加入5-10 个提前备好的生物冰袋，打包运输；
4) 血液采集后 3 天内寄送，尽量避免放置时间过久，运输选择时效性好的快递公司，尽量 2 天内送到。
注意：采血管需要包裹严实，和冰袋用缓冲物隔开，样本置于包装箱体中间，避免运输 过程碰撞损坏，防止血液结冰。
血液冻存样本
1) 使用紫头 K2EDTA 或 Na2EDTA 抗凝管（不建议使用肝素、柠檬酸钠等），做好相应标记。；
2) 采集一定量血液后颠倒缓慢混匀十次左右，使抗凝剂和血液充分混合，转入4℃保存；
3) 将采集好的血液：Trizol试剂按照1:3比例混合，使用移液器反复吹打混匀，置于涡旋混合器再次震荡混匀，直接放入-80℃冰箱冻存；
4) 准备纸质送样信息单，核对信息无误，备注：血液和Trizol按照1：3比例添加。足量干冰运输，在RNA提取前避免样本反复冻融，运输选择时效性好的快递公司，尽量2天内送到。
5. 细菌样本
1)收集液体培养基中对数生长期的菌体，通过低速离心收集菌体并尽可能将培养基去除干净，然后用无菌水或PBS缓冲液冲洗样品1~3遍，送菌液沉淀，液氮速15 min以上，-80℃冻存；
2) 不建议加TRIzol，影响菌体裂解；
3) 直接送滤膜时，建议送样≥5张，不要将多张滤膜叠在一起后速冻寄送，将滤膜一张一张放入50ml离心管，液氮速15 min以上，-80℃冻存；
3. 4) 足量干冰运输，在RNA提取前避免样本反复冻融。
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