项目文章｜ONT全长转录组+简单验证，牦牛生长发育机制研究轻松拿捏高分文章

英文标题：Complete characterization of the yak testicular development using accurate

full-length transcriptome sequencing

发表时间：2024.6

发表期刊：International Journal of Biological Macromolecules

IF：7.7

通讯作者：郭宪/裴杰（中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所）

牦牛（Bos grunniens）广泛分布于青藏高原的高寒地带，因其强大的适应力被誉为“万能家畜”，是当地牧民生计的主要支柱。牦牛可以提供肉类、奶类、毛皮和燃料，但是其独特的生长环境和低繁殖效率，如营养不良、季节性发情及低怀孕率，限制了其生产力。睾丸在雄性生殖过程中极为关键，因此理解睾丸的发育过程对提高牦牛繁殖效率具有重要意义。然而，由于短读长RNA测序在解析复杂基因结构方面的局限性，导致牦牛睾丸发育的分子机制尚未被充分认识。因此，本研究采用了牛津纳米孔技术（ONT）进行全长转录组测序，全面描绘了牦牛和杂交牛不同发育阶段的睾丸转录组，以揭示其发育中的分子调控机制。贝纳基因在该研究中承担了ONT全长转录组的测序及部分分析工作。

图：实验设计

1. 全长转录本的鉴定和功能注释

本研究以6月龄、18月龄、30月龄、4岁的公牦牛和4岁的杂交牛为研究对象，各年龄阶段选取3个个体的睾丸样本，进行ONT全长转录组测序。每个样本产生了9100484到13084496条clean reads，平均读长为937.7 bp。通过与参考基因组比对，鉴定到24480个基因和40038个新转录本，其中大部分为新转录本（图1A）。基于Uniprot、Pfam、GO、KEGG、KOG和NR数据库，对新转录本进行功能注释，其中9568个新转录本被注释到。GO注释显示大多数新转录本注释到细胞结构组分功能中，KEGG注释则显示大部分转录本注释到信号转导及免疫系统途径等通路中，KOG注释中主要为一般功能预测、翻译后修饰、蛋白质周转、信号翻译机制，NR同源物种注释显示，家牛（Bos taurus）、野牦牛（Bos mutus）和美洲野牛（Bison bison）是最近缘的同源物种。随机选取10个新转录本进行PCR验证，结果显示PCR扩增产物的大小与目标一致，表明ONT测序结果准确（图1）。

图1：全长转录本的鉴定和功能注释

2. 可变剪接事件的鉴定

分析鉴定得到15355个可变剪接事件，这些事件分为7种不同的类型，包括714个外显子跳跃、2351个3’可变剪接、2150个5’可变剪接位点、2877个第一个外显子剪接、1344个末端外显子剪接、1379个互斥外显子和1540个内含子保留。在不同年龄阶段的牦牛中，剪接事件的分布具有显著差异，6月龄的可变剪接事件显著少于其他阶段，可能是由于该阶段处于青春期前，睾丸尚未进入减数分裂期，精子发生过程尚未启动，因此相关的剪接事件数量相对较少（图2）。

图2：可变剪接事件的鉴定

3. SSR、转录因子和融合转录本的预测

对超过500 bp的转录本进行SSR分析，共识别出25798个SSR事件，这些SSR位点的重复单位从1到6个碱基不等，其中单核苷酸重复是最常见的类型，占比为54.57%。此外，使用动物转录因子数据库（animalTFDB）对转录因子进行预测，共识别出7628个转录因子，zl-C2H2家族是最主要的转录因子家族，占比达31.85%。使用Tofu比对分析检测到7645个融合转录本，大部分由不同染色体事件形成。随机选择多个lncRNA、融合转录本和可变剪接事件进行PCR验证，结果显示这些产物的大小与预期相符，进一步表明ONT测序结果准确可靠（图3）。

图3：SSR、转录因子和融合转录本的预测

4. 差异表达转录本的鉴定和验证

通过不同发育阶段的比较，鉴定得到多个差异表达转录本（DETs）。从6个月龄到18个月龄，再到30个月龄和4岁龄，差异表达转录本的数量逐渐增加，这表明随着牦牛年龄的增长，其睾丸组织中的转录本表达变化更为显著。通过火山图可知不同阶段转录本表达变化不同，18月龄与6月龄相比，上调的转录本数量明显多于下调的转录本，而在公牦牛与杂交牛中，下调的转录本数量多于上调的转录本。RT-qPCR进一步验证了随机选择的6个转录本在不同发育阶段的变化趋势，结果与ONT测序一致（图4）。

图4：差异表达转录本的鉴定和验证

5. 加权基因共表达网络分析

利用WGCNA方法，构建了不同发育阶段牦牛睾丸样本的基因共表达网络，分析得到21个共表达模块。其中蓝色模块与6月龄阶段具有最高的相关性，而深灰色模块与18月龄阶段紧密相关。KEGG通路富集分析显示不同发育阶段与特定信号通路存在显著关联，例如早期发育阶段（6月龄）主要与细胞结构、激素合成和蛋白质合成相关的通路有关，中期发育阶段（18月龄和30月龄）涉及多种代谢通路和Hippo信号通路，较晚期发育阶段（4岁）则与代谢和激素合成相关的通路有关，这些通路的活跃可能有助于为后续精子发生创造适宜的微环境。（图5）

图5：加权基因共表达网络分析

6. 各阶段关键基因调控网络构建

为了进一步探究各阶段特异模块中基因的潜在调控关系，使用Cytoscape软件可视化不同模块中位于连通节点处的前50个基因，发现1) 蓝色模块中SLMAP、ENSBGRG00000004758和novel11067为核心基因；2) 深灰色模块中novel7446为核心基因；3) 深橙色模块中novel6847和novel4566为核心基因；4) 青绿色模块中novel11503为核心基因；5) 棕色模块中REEP5为核心基因。这些核心基因在不同发育阶段的特异性表达表明它们在睾丸发育中的重要作用。例如，SLMAP在精子鞭毛的形成中具有重要功能，而REEP5在成年阶段的表达可能与睾丸成熟及精子生成的能量代谢密切相关（图6）。

本研究通过ONT测序系统分析了牦牛和杂交牛不同发育阶段的睾丸转录组，识别出大量的新转录本及其功能特征，极大地丰富了牦牛睾丸的基因组数据。研究表明，牦牛在从青春期到成年期的发育过程中涉及复杂的基因调控网络和多样的分子机制，这些机制主要通过多个通路及多种调控机制影响其生殖系统的发育和功能。研究成果为进一步理解牦牛的生殖生物学以及遗传改良提供了重要的理论基础和科学依据，同时也为提高牦牛和杂交牛的繁殖效率指明了新的研究方向。

参考文献：

Wang X, Guo S, Xiong L, et al. Complete characterization of the yak testicular development using accurate full-length transcriptome sequencing[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2024, 271: 132400.

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