Nature子刊项目文章｜氧气通过维持EGLN1催化的IRF3脯氨酸羟化来增强抗病毒的先天免疫

氧气是需氧生物体生存的必要条件，但它在抗病毒免疫中的作用尚不明确。本文揭示了氧气通过 EGLN1 促进抗病毒先天免疫的新机制。研究发现，在低氧条件下，抗病毒响应基因的表达被抑制，这一效应独立于 HIF 信号传导途径。EGLN1 作为一种关键的氧气传感器，通过催化 IRF3 在第 10 号位点的脯氨酸羟基化来增强抗病毒免疫。羟基化的 IRF3 更容易被磷酸化、形成二聚体并转移到细胞核中，从而激活抗病毒基因。通过条件性敲除小鼠模型和使用 EGLN 抑制剂 FG4592，证实了 EGLN1 在体内对病毒防御的重要性。此外，携带 Irf3 P10A 突变的小鼠对病毒感染更为敏感。这些发现揭示了氧气与抗病毒反应之间的直接联系，并为氧气如何调节先天免疫机制解析提供了重要线索。

文章标题：Oxygen enhances antiviral innate immunity through maintenance of EGLN1-catalyzed proline hydroxylation of IRF3

发表期刊：Nature Communications (IF = 14.7)

发表时间：2024.04

贝纳基因协助完成了RNA-seq工作。

1、氧气增强细胞抗病毒免疫反应 

降低水中氧气浓度会显著降低病毒感染后斑马鱼的存活率，推测氧气与病毒免疫之间存在一定关联。在低氧条件下（1% O₂），H1299 细胞中 HIF1α 蛋白稳定化，并且典型的低氧响应基因表达发生上调。同时，抗病毒基因 IFN-β 和 CXCL10 的表达在低氧条件下显著降低。通过敲除 HIF1β 或使用 HIF1α 抑制剂 PX478 排除了 HIF 信号通路对抗病毒基因表达的影响，但仍观察到低氧条件下 IFN-β 和 CXCL10 的表达减少。在人单核细胞系 THP-1 中也获得了类似的结果。随着氧气浓度从 21% 降至 1%，HIF1α 蛋白稳定增加，而 IFN-β 和 CXCL10 的表达下降。这些结果表明，氧气能促进免疫细胞和非免疫细胞中的先天抗病毒反应，且该作用独立于 HIF 信号通路。

图1 在病毒感染的情况下，缺氧独立于HIF信号通路抑制抗病毒基因的表达

2、EGLN1 通过其酶活性正向调控细胞抗病毒免疫反应 

EGLN1 通过催化靶向蛋白的脯氨酸羟基化传递氧气信号。过表达 EGLN1 显著增强了 IFN-β、CXCL10 等抗病毒基因的表达，并减少了病毒感染细胞的比例。相反，在 EGLN1 缺失的细胞中，这些抗病毒基因的表达减少，且感染细胞比例增加。使用催化失活的 EGLN1 突变体（H313A）证实了 EGLN1 的酶活性对于其正向调控抗病毒免疫反应至关重要。此外，使用 EGLN 脯氨酰羟化酶抑制剂 FG4592 也抑制了抗病毒基因的表达，并促进了病毒在细胞中的复制。这些结果表明 EGLN1 及其酶活性是氧气介导的抗病毒免疫反应的关键调节因子。

图2 EGLN1 依赖于其酶活性正向调节细胞的抗病毒免疫反应

3、体外和体内实验中敲除 Egln1 均导致病毒易感性增加

体外实验显示，敲除小鼠中的 Egln1 基因增加了对致命病毒感染的易感性，表现为病毒诱导的 Ifn-β 表达下降和病毒复制增强。体内实验中，条件性敲除Egln1 的小鼠显示出更严重的病毒感染引起的组织损伤和较低的 Ifn-β 水平，同时对病毒感染更为敏感。使用小分子抑制剂 FG4592 抑制 EGLN 活性也导致抗病毒基因表达减少和对病毒感染的易感性增加。在斑马鱼模型中，egln1a 和 egln1b 双敲除导致对GCRV（草鱼呼肠孤病毒）和 SVCV（鲤春病毒血症病毒）感染的敏感性增加，并伴随着抗病毒基因表达下降。FG4592 处理的斑马鱼同样表现出对 SVCV 感染的敏感性增加和抗病毒基因表达的下调，进一步验证了 Egln1 在促进抗病毒免疫中的进化保守作用。

4、EGLN1 与 IRF3 相互作用以增强 IRF3 的激活 

EGLN1 增强对 RNA 和 DNA 病毒的抗病毒反应，推测它可能通过调节 RLR 和 cGAS-STING 信号通路下游的共同因子发挥作用。IRF3 作为这两个途径的共同效应因子和 I 型干扰素的关键转录因子，成为 EGLN1 调节的潜在目标。通过 GST pull-down 实验和免疫共沉淀实验表明，EGLN1 与 IRF3 在细胞质中共定位并直接相互作用，且EGLN1 的 C 末端 PH 结构域和 IRF3 的 IAD 结构域对于互作至关重要。仅 EGLN1 而非 EGLN2 或 EGLN3 能够增强 IRF3 对 IFN-β 表达的诱导。在 IRF3 缺失的细胞中，EGLN1 过表达不影响 IFN-β 表达，病毒复制也不受抑制，这表明 IRF3 对 EGLN1 在抗病毒免疫中的作用至关重要。使用缺乏 I 型 IFN 产生的 Vero 细胞进一步证实了 I 型 IFN 在介导 EGLN1 功能中的重要性。这些结果表明 EGLN1 通过调节 IRF3 的活性来发挥其在抗病毒免疫中的特定作用。

5、EGLN1 羟基化 IRF3 的脯氨酸 10 号位点

通过质谱分析，作者鉴定出 IRF3 可以被 EGLN1 在脯氨酸 10号位点 (P10) 羟基化，这一位点具有进化保守性，并使用特异性识别 IRF3 脯氨酸羟基化的抗体得以证实。在外源表达的 EGLN1 催化下，IRF3 发生了脯氨酸羟基化，而催化失活的 EGLN1 突变体 (H313A) 或 IRF3 的脯氨酸10号位点突变为丙氨酸 (P10A) 时，则没有观察到羟基化。低氧条件或羟基化酶抑制剂 DMOG 的处理显著降低了 IRF3 的脯氨酸羟基化水平。体外羟基化试验进一步证实了 IRF3 是 EGLN1 的真正底物，并且可以在 EGLN1 的催化下被充分羟基化。

6、EGLN1 促进 IRF3 的磷酸化、二聚化及核转位 

EGLN1 不影响 IRF3 的蛋白稳定性，但在病毒感染过程中，EGLN1 的存在促进了 IRF3 的磷酸化和二聚化，这对于 IRF3 的激活至关重要。具体来说，在 SeV、VSV 或 HSV-1 感染后，EGLN1−/− 细胞中的 IRF3 磷酸化和二聚化水平低于 EGLN1+/+ 细胞。过表达野生型 EGLN1 能够促进 IRF3 的磷酸化和二聚化，而催化失活的 EGLN1 (H313A) 则不能。此外，EGLN1 还促进了 IRF3 的核转位。

图3 EGLN1 增强 IRF3 的磷酸化、二聚化和核转位

7、在细胞抗病毒免疫反应中，IRF3 在脯氨酸10号位点的羟基化增强了 IRF3 的激活 

启动子实验显示，过表达的 P10A IRF3 的转录活性远低于过表达的野生型 IRF3。过表达 EGLN1 增强了野生型 IRF3 诱导的 IFN-β、Cxcl10 和 ISG15 mRNA的上调，但对过表达P10A IRF3 没有影响。此外，外源表达的野生型 IRF3 比 P10A IRF3 能够更有效地抑制 VSV-GFP 病毒感染，并更容易进入细胞核，与 TBK1 的相互作用也更多。

8、小鼠Irf3 脯氨酸羟基化缺陷减弱抗病毒先天免疫 

在小鼠中，Irf3 在脯氨酸10号位点的羟基化在 VSV 感染 24 小时后减少，推测可能存在负反馈机制调节 Irf3 羟基化以响应病毒感染。使用 CRISPR/Cas9 构建 Irf3_P10A 突变小鼠模型，结果显示这些小鼠在标准饲养条件下正常生长和繁殖。在 Irf3_P10A 小鼠中未检测到 Irf3 的脯氨酸10号位点羟基化，并且与野生型小鼠相比，Irf3_P10A 小鼠对 VSV 和 HSV-1 更敏感，且在病毒感染后表现出更严重的肺部损伤。

图4 Irf3 的脯氨酰羟基化缺陷减弱了小鼠中的抗病毒先天免疫

基于以上结果，本研究提出一个氧气增强抗病毒先天免疫的机制模型：在正常含氧条件下和病毒感染期间，由于氧气充足，EGLN1 的活性得以维持，导致 IRF3 在脯氨酸10号位点的羟基化并促进其发生磷酸化、二聚化和核转位，进而激活 IRF3 以通过转录激活 I 型干扰素基因及相关基因，从而引发抗病毒先天免疫反应。然而，在缺氧条件下，EGLN1 的活性被关闭，阻碍了 IRF3 的脯氨酸羟基化，导致 IRF3 的磷酸化、二聚化、核转位及其后续激活的减少。

本研究首次揭示了氧气如何通过调节EGLN1的活性及其对IRF3的脯氨酸羟基化直接影响抗病毒免疫反应，强调了氧气在调节先天免疫中的重要作用。这一发现不仅有助于理解氧气如何影响免疫反应，也可能指导未来开发新的抗病毒治疗策略。此外，研究还强调了细胞内氧气感应机制的重要性，并可能对疾病治疗提供新的靶点，如通过调节IRF3的羟基化来增强抗病毒反应。

参考文献：

Liu, X.. et al. Oxygen enhances antiviral innate immunity through maintenance of EGLN1-catalyzed proline hydroxylation of IRF3. Nature Communications, 2024.

https://doi.org/10.1038/s41467-024-47814-3

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