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英文标题：A telomere-to-telomere cotton genome assembly reveals centromere evolution and a Mutator transposon-linked module regulating embryo development
发表时间：2024.08.15
发表期刊：Nature Genetics
影响因子：31.7
2024年8月《Nature Genetics》杂志在线发表了题为A telomere-to-telomere cotton genome assembly reveals centromere evolution and a Mutator transposon-linked module regulating embryo development的研究成果，武汉大学/北京大学教授朱玉贤，北京大学博士后黄盖为主要主要作者。本研究组装了T2T级别的二倍体雷蒙德氏棉基因组图谱，揭示了其独特的着丝粒结构类型及表观图谱。通过深入挖掘功能性转座子，发现由三个新分子（miR2947-DNA转座子MuTC01-加倍基因LEC2b）组成的三级小RNA调控机制，从而阐明了棉花复杂折叠胚胎形成的分子调控与演化机制。
研究背景
棉花（Gossypium）起源于500-1000万年前，经历快速多样化后形成了八个二倍体基因组群（A-G和K基因组群）。如今作为重要经济作物的棉花栽培种形成于1.0-1.6百万年前，是通过二倍体A基因组和D基因组的祖先（两者均为2n=2×=26）杂交后经历多倍化事件而形成的异源四倍体（AD基因组，2n=4×=52）。雷蒙德氏棉（Gossypium raimondii）被认为是所有异源四倍体棉花中D亚基因组的最近祖先。考虑到其在棉花进化中的重要性，已有多项研究公开了雷蒙德氏棉基因组的组装结果，但至今尚未有基因组的端到端（T2T）序列组装的研究报道。
主要研究结果
1. T2T基因组组装、注释和着丝粒进化
本研究T2T基因组组装使用的测序技术和测序深度：ONT ultra-long 测序（130×，104 Gb）；Pacbio HiFi测序（93×，75 Gb）；Hi-C测序（130×，106 Gb）。最终组装的基因组大小为776 Mb，13条染色体都组装到了gapfree的水准，并鉴定了25个典型端粒重复单元的完整染色体末端。本研究组装的雷蒙德氏棉基因组中，460 Mb（59.27%）的序列是转座元件（TEs），通过高深度的转录组数据注释了53,167个完整的蛋白编码基因，高于所有已报道的雷蒙德氏棉基因组注释结果。
研究团队通过CENH3抗体的ChIP-seq验证了13个着丝粒区域，长度从1.2 Mb到2.5 Mb不等。对结合在CENH3上的棉花着丝粒区域的分析表明，雷蒙德氏棉的着丝粒区域主要由LTR转座子组成，这表明其功能性着丝粒序列在LTR转座子中，而不是在水稻以及拟南芥的经典着丝粒微卫星重复序列中。此外，雷蒙德氏棉着丝粒区域有CENH3核小体相位排布规律，其长度与拟南芥的CEN180以及水稻的CentO类似，但是拟南芥和水稻着丝粒的LTR区域并没有这种相位模式。
图 1 雷蒙德氏棉组装、着丝粒结构比较和表观遗传分析
2. 鉴定反式作用siRNA生成位点MuTC01
雷蒙德氏棉基因组中含有大量LTR和末端反向重复（TIR）转座子，其中TIR转座子拷贝数明显高于拟南芥、水稻和玉米，Mutator家族占TIR类型的50%。对不同雷蒙德氏棉组织和不同生长阶段进行了TEs的全基因组表达图谱分析，发现只有一小部分棉花TEs（0.11-0.25%）在可检测水平。在授粉20天（20 DPA）的胚珠组织中，有88个TEs在子叶阶段表现出组织特异性，其中一段591 bp的DNA MuDR转座子（此后称为MuTC01），在胚珠中显示了最高的组织特异性表达。MuTC01产生大量的22 nt的siRNA，占总siRNA 的45.4%，因此被确定为产生siRNA的一个位点。
图 2 鉴定雷蒙德氏棉中胚珠特异表达，反式作用，并产生siRNA的MuTC01位点
3. miR2947和MuTC01控制棉花胚胎发生和胚胎折叠
通过筛选miRBase数据库中的棉花miRNAs，研究团队发现MuTC01的149-170 bp区域特异地被miR2947靶向切割生成siRNA，并通过降解组测序验证了切割的位点。为了评估这种调节模块的生物学功能，研究团队利用CRISPR-Cas9技术敲除了异源四倍体陆地棉基因组的miR2947或MuTC01同源基因，通过形态检查和石蜡切片，发现敲除miR2947或MuTC01的突变体在23 DPA出现明显的发育缺陷，且时间越长越明显。
图 3 miR2947对于启动MuTC01产生siRNA的过程至关重要
MuTC01生成的所有siRNA识别了50个候选靶基因，其中10个在20 DPA的胚珠中检测出有转录表达，编码B3结构域转录因子的叶芽发育素2基因（以下称为LEC2b），具有最低的靶标得分和最高的siRNA产生水平。LEC2b由祖先基因LEC2a在距今17.87-21.96百万年进化而来，系统发育分析表明LEC2a与在拟南芥和与棉花近缘的可可等植物中发现的LEC2基因关系更为密切，LEC2b可能是由基因组复制事件产生。随后研究团队通过CRISPR-Cas9技术确认了LEC2b是miR2947-MuTC01调控模块的靶点，提出miR2947-MuTC01-LEC2b三部分组成的调控网络通过LEC2b产生三级siRNA控制棉花胚胎复杂折叠。
图 4 miR2947-MuTC01-LEC2b调控网络调节棉花子叶折叠
4. 子叶复杂折叠的演化
研究团队比较分析了三级调控模块的演化起源时间，通过横跨双子叶植物物种的系统发育分析，调控因子miR2947、MuTC01和LEC2b同时存在于具有复杂折叠形态胚胎的棉族。根据从木槿获得的实验数据，以及mir2947、mutc01和lec2b-2敲除突变体的数据，研究团队提出三级小RNA调控棉族独特胚胎类型的分子和演化机制，即棉族特异的MIR2947产生第一级22-nt的miR2947，直接靶向DNA转座子MuTC01，产生第二级小RNA，再靶向全基因组加倍产生的LEC2b基因，产生第三级小RNA，从而调控棉族复杂折叠胚胎形成。
图 5 棉花胚胎复杂折叠的演化模型
总结
本研究使用多种测序技术实现了雷蒙德氏棉基因组的T2T组装，大幅提高了雷蒙德氏棉的基因和转座子注释准确性，为进化和功能基因组学研究提供了宝贵资源。研究团队解析了棉花的着丝粒进化，并发现了一种棉族特有的DNA转座子MuTC01，提出miR2947、MuTC01和LEC2b三部分组成的三级调控模块调控子叶的发育。该工作为不同胚胎类型的形成提供了线索，并为被子植物如何在不同环境中适应和生存提供了见解。
参考文献：
1 Huang, Gai, et al. "A telomere-to-telomere cotton genome assembly reveals centromere eolution and a Mutator transposon-linked module regulating embryo development." Nature Genetics (2024): 1-11.
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