NC解读｜ONT和PacBio全长转录组测序揭示阿尔茨海默病模型中内嗅皮层的差异性剪接

英文标题：Long-read transcript sequencing identifies differential isoform expression in the entorhinal cortex in a transgenic model of tau pathology

发表期刊：Nature Communications（IF：14.7）

发表时间：2024.8.02

通讯作者：英国埃克塞特大学临床与生物医学科学系的 Jonathan Mill 团队

 图1 研究方法

1. 全长转录组测序识别与tau病理进展相关的特定Gfap转录本

本研究利用全长转录组测序技术（PacBio Iso-Seq）对2个月和8个月龄的野生型(WT)和TG小鼠进行测序，分析了转基因 (TG) 小鼠内嗅皮层 (EC) 中的选择性剪接和转录本表达变化。研究发现，人类MAPT转录本仅在TG小鼠中被检测到，证实了转基因的有效表达。通过短读长测序数据，发现野生型和TG小鼠中，与tau病理进展相关的基因Gfap（编码神经胶质纤维酸性蛋白）表现出显著的差异表达，并通过Iso-Seq数据确认了其主要转录本Gfap-201的上调。进一步通过ONT全长转录组测序技术，发现Gfap-201在8个月龄TG小鼠的胶质细胞中表达显著增加，这表明胶质细胞反应可能是tau病理进展中的关键因素。

图2 Gfap转录本的上调与TG小鼠中tau病理的进展有关。

2. 超深度靶向全长转录组测序可识别数百种罕见的新转录本

为了更全面地分析与tau病理相关的选择性剪接，本研究使用ONT和PacBio全长转录组技术对更大数量的野生型(WT)和转基因(TG)小鼠进行了超深度靶向长读长测序，重点关注20个与阿尔茨海默病相关的基因。测序共获得了超过500万条reads，涵盖了81,221个转录本，其中 95.8%是新转录本且大部分非常罕见。通过靶向测序，检测到的转录本数量显著高于二代转录组测序的结果。这些数据揭示了每个基因大约2200个罕见转录本，虽然它们各自占比很小，但总体上构成了相当大比例的reads占比。本研究还发现Apoe、Clu和Snca的已知转录本占了很大比例的靶向reads。大多数基因由少数“主要”转录本组成，与现有数据库中的观察一致。

图3 靶向长读长测序识别出了与AD病理有关基因中的异构体多样性和可变剪接事件。

3. FICLE是一种从长读长测序数据中表征异构体的新工具

现有的短读长RNA-Seq技术难以捕捉到长读长测序中的转录本复杂性，本研究开发了名为FICLE（通过长读长测序实验进行完整的异构体表征）的新的生物信息学工具，它可以全面注释转录本，并提供详细的转录本特征描述。FICLE通过直接比较长读长转录本与参考序列之间的剪接位点，揭示了转录本的多样性和剪接模式。该工具能够识别新颖的外显子，并可视化不同类型的剪接事件，为生物学研究提供有价值的数据分析支持。

4. TG小鼠中tau病理进展相关的转录本差异表达

通过对超深度ONT测序数据的分析发现与tau病理进展相关的6个基因（Apoe、App、Cd33、Clu、Fyn和Trem2）中有12个差异表达转录本(DETs)，且在TG小鼠中均上调，其中有5个是新转录本。另外，发现了48个来源于10个基因与基因型相关的DETs，其中多数在tau病理小鼠中上调，特别是Trem2的转录本。此外，观察到与tau病理相关的主要转录本表达发生了变化，涉及Fus、Bin1、Trpa1、Vgf、Clu等基因。

图4 差异转录表达与TG小鼠中tau病理进展相关。

5. 主导Trem2转录本的上调与TG小鼠中升高的tau病理相关

在TG小鼠中，两种已知的Trem转录本（LR.Trem2.62 和 LR.Trem2.54）与tau病理进展显著相关。这两种转录本在老龄TG小鼠中表达上调，并主要在非神经元（富含胶质细胞）的细胞核中表达。免疫组织化学结果显示，上调的Trem2定位于活化的小胶质细胞中，这些细胞与磷酸化tau接触。与人类表达最多的TREM2转录本相比，LR.Trem2.54 具有很高的同源性。尽管Trem2显示出较高的转录本多样性，LR.Trem2.54 的显著上调是导致老龄TG小鼠中Trem2表达增加的主要原因。

图5 不同的Trem2转录本随着TG小鼠tau病理的进展而上调。

6. Clu-201的上调导致与tau病理相关的基因表达和转录本使用的差异

与TG小鼠tau病理进展相关的差异表达转录本(DETs)之一的Clu，是一种多功能糖蛋白，与阿尔茨海默病(AD)强烈关联。共检测到了964个Clu转录本，与tau病理进展相关的DETs中，LR.Clu.139（对应主导转录本Clu-201）和另外三种Clu新转录本在老龄TG小鼠中上调表达。这些DETs的增加反映了Clu基因整体表达水平的增加。转录本使用的变化也与tau病理进展相关，其中LR.Clu.139的比例相对于其他转录本增加。

图6 Clu-201的上调导致与tau病理相关的基因表达和转录本使用的差异。

7. 与tau病理进展相关的Bin1转录本的差异使用

人类Bridging Integrator 1基因 (Bin1) 与阿尔茨海默病(AD)密切相关。在TG小鼠模型中，观察到Bin1具有丰富的转录本多样性和广泛的选择性剪接事件。本研究鉴定了两种主要的Bin1转录本：LR.Bin1.99（已知转录本）和LR.Bin1.101（新转录本）。尽管LR.Bin1.99的表达在不同基因型之间基本一致，但在8个月龄TG小鼠中，其表达显著下调，而LR.Bin1.224的表达则显著上调。这些发现与人类AD组织中BIN1转录本的变化模式一致，表明特定Bin1转录本的变化可能在tau相关疾病进展中发挥重要作用。

图7 Bin1中的异构体转换与TG小鼠中的tau病理有关。

8. 人类AD大脑皮层中存在与TG小鼠相似的转录本表达

为了探讨TG小鼠中观察到的转录本水平表达差异是否也能反映人类阿尔茨海默病(AD)中的变化，本研究对死后人脑皮层组织进行了ONT测序。检测到了20个靶向基因的转录本，包括数百种罕见的新转录本。这些转录本在外显子结构上与在小鼠大脑皮层中识别到的转录本相似。在这20个基因中，大多数基因的表达由几种主要转录本主导，这些转录本与小鼠中的主要转录本同源。例如，人类主导的TREM2转录本（LR.TREM2.25）与小鼠中主导的Trem2转录本同源。在AD患者的皮层组织中，主导的TREM2转录本显著上调，这与在TG小鼠中观察到的情况相似。这些发现提示在TG小鼠和人类AD中观察到的转录本水平变化之间存在相似性。

图8 人类皮层中AD相关基因的转录本多样性

本研究采用ONT和Pacbio全长转录组测序技术并结合一种新的生物信息学工具(FICLE)来分析转基因(TG)小鼠内嗅皮层的转录本多样性，揭示了选择性剪接在AD病理中的重要性，并提供了新的见解：即使在基因层面没有明显的表达变化，转录本使用的差异也可能导致AD相关病理的发展。未来的研究可以进一步探索这些差异性剪接对于开发AD诊断和治疗策略的潜在意义。

参考文献：

Leung SK, et al. Long-read transcript sequencing identifies differential isoform expression in the entorhinal cortex in a transgenic model of tau pathology. Nature Communications. 2024.