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碱基编辑器(base editors, BEs)在不引起DNA双链断裂及无需DNA模板的情况下可对特定碱基高效、精准改变。BEs在治疗各种遗传性疾病方面已表现出巨大潜力，例如高胆固醇血症、哈金森-吉尔福德早衰综合征、杜氏肌营养不良症、Leber先天性黑朦、镰状细胞贫血症和β-地中海贫血症等。值得注意的是，目前BEs已经被用于疾病治疗的临床试验，包括家族性高胆固醇血症和急性淋巴细胞白血病。在听觉领域中，全球约有2600万人患有先天性耳聋，其中约60%的病例与遗传因素有关，80%为隐性发病，但临床上尚无批准的治疗药物。腺嘌呤碱基编辑器(adenine base editors, ABEs)能精准地将A·T碱基对转换为G·C碱基对，是治疗G-to-A或C-to-T致病性突变的潜在工具，其在耳聋治疗上尚无研究报道。
2024年8月12日(当地时间)，复旦大学附属眼耳鼻喉科医院舒易来教授团队，于期刊Nature Biomedical Engineering发表题为《碱基编辑器长期挽救隐性重度耳聋小鼠的听觉功能》(A base editor for the long-term restoration of auditory function in mice with recessive profound deafness)的论文。该工作研发出针对OTOF c.2485C>T突变所致耳聋的ABE碱基编辑器治疗体系，恢复了88%的内耳内毛细胞的耳畸蛋白(Otoferlin)表达，且在长达1.5年的时间内将听力恢复至近野生型水平。这是耳聋基因治疗领域，在动物模型中迄今观察时间最长的有效结果(小鼠的平均寿命约为2年左右，人的预期寿命平均约80岁)。
先天性耳聋是指在婴儿出生时或出生后不久发生的听力损失，发病率约1-3/1000，遗传因素是先天性耳聋的主要致病因素，临床上目前尚未有治疗药物。听神经病谱系障碍(Auditory neuropathy spectrum disorder, ANSD)是一种常见的先天性耳聋类型，其中OTOF是最常见的致聋基因，其突变导致常染色体隐性遗传性耳聋9型(autosomal recessive deafness 9, DFNB9)，患者通常表现为双侧耳重度至完全听力损失和言语障碍。OTOF是第一个被发现的ANSD致病基因，且2-8%的遗传性耳聋病例也与OTOF基因突变有关。
在该研究中，研究团队首先构建了模拟OTOF c.2485C>T，p.Q829X突变耳聋患者的小鼠模型(Otof c.2482C>T, p.Q828X)，杂合突变小鼠听力正常，纯合突变小鼠表现为先天性完全听力损失，其听力表型与患者一致。然后，研究人员针对c.2482C＞T突变位点周围的序列进行分析及设计单链向导RNA(single-guide RNA, sgRNA)，选用了三种识别非经典PAM序列的SpCas9变体，即SpCas9-NG(5’-NGN)、SpG(5’-NGN)和SpRY(5’-NR/YN)，结合2种腺嘌呤脱氨酶(TadA-8e和ABE7.10max)。体外评估了六种ABE组合对突变位点的编辑情况，从中筛选出编辑效率高且旁观者编辑低的治疗体系(脱氨酶ABE7.10max和SpCas9-NG组合)。为实现体内递送，采用基于内含肽的反式剪切蛋白重组策略，构建了双腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)介导的碱基编辑器治疗系统，即AAV_NG-ABE7.10max。
随后，研究人员将AAV_NG-ABE7.10max治疗体系通过耳蜗圆窗路径显微注射至出生后(postnatal, P)1-3天的OtofQ828X/Q828X小鼠内耳中，在基因组和转录组水平上均观察到致病突变被精确纠正，且未观察到明显的脱靶情况。治疗后8周，发现88.0±4.4%的内毛细胞恢复了otoferlin蛋白表达；听性脑干反应表明OtofQ828X/Q828X小鼠的听觉功能长期(至少1.5年)稳定地从完全听力损失(＞90 dB)恢复至近野生型水平。免疫荧光染色结果显示治疗后内毛细胞的突触数量增多，电生理结果显示突触囊泡短期释放和长期补充功能也恢复至近野生型水平。最后，将AAV_NG-ABE7.10max治疗体系注射至听力形成后阶段的P13-14 OtofQ828X/Q828X小鼠内耳中，观察到OtofQ828X/Q828X小鼠的听力也能恢复至近野生型水平至少19周，听觉惊吓反应和前脉冲抑制率也表明听觉功能明显改善。此外，研究人员还开发了针对人类OTOF c.2485C>T、p.Q829X位点的ABE治疗策略，有效恢复了人源化OtofQ829X/Q829X小鼠的听功能。
瑞士巴塞尔分子和临床眼科研究所的Bence György教授同期也于期刊Nature Biomedical Engineering上针对该工作发表题为“A base editor for correcting deafness”(纠正耳聋的碱基编辑器)的News & Views文章，评论“鉴于DFNB9型耳聋可通过基因干预治愈，并且双AAV载体系统在人体中展现出安全有效的特性，表明碱基编辑技术在耳聋基因治疗的临床应用前景可期。”(https://doi.org/10.1038/s41551-024-01234-2)
综上所述，该研究不仅拓展了碱基编辑器在人类疾病治疗中的应用，也为ABE治疗遗传性耳聋的临床转化提供了可靠的科学数据支撑和理论指导，将有望为遗传性耳聋治疗提供新的潜在方案。
值得一提的是，同样是针对OTOF致聋基因，舒易来团队还研发出基于AAV的双载体基因置换疗法(AAV1-hOTOF)，且将其推进至临床转化。据悉，该团队于2022年12月完成了全球首例OTOF遗传性耳聋患儿基因治疗，先后纳入11例患者完成基因治疗，目前最长的患者随访时间已达1年8个月，患者可以进行日常交流。该基因治疗临床研究研究成果发表在国际顶级医学期刊The Lancet和Nature Medicine上，并被The Lancet选为封面导读，获该期刊同期点评，被国际同行称为“耳聋治疗的范式转变”、“标志着基因治疗听觉障碍乃至更广泛疾病的新时代开启”。
注：文中插图源于 Nature Biomedical Engineering
原文链接：
https://doi.org/10.1038/s41551-024-01235-1
来 源 复旦大学附属眼耳鼻喉科医院
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