受理号：CSZ2200086
体外诊断试剂产品注册技术审评报告
产品中文名称：人 EGFR/ALK/ROS1/MET 基因突变检测试剂盒（多重荧光 PCR 法）申 请 人 名 称 ：厦门艾德生物医药科技股份有限公司国家药品监督管理局
医疗器械技术审评中心
基本信息
技术审评概述
试剂盒包括两个部分：RNA 基因融合检测和 DNA 基因突变检测。RNA 基因融合检测组成成分包括 LET 反应条 A(LET A)、LET 逆转录液 I、LET 逆转录液 II、LET 逆转录酶、LET 混合酶 A 和 LET 阳性对照 A。LET 逆转录液 I、LET 逆转录液 II和 LET 逆转录酶用于样本 RNA 逆转录成 cDNA；LET 反应条A(LET A)和 LET 混合酶 A 用于样本 cDNA 扩增检测。PCR 反应液已预先分装于 PCR 8 联管(LET A)中，8 联管内装有各自相应的 PCR 反应液，RNA 基因融合检测由①号管和⑤~⑦号管FAM 信号指示，①号管和⑤~⑦号管 VIC 信号用于指示 RNA 样本质量和质控实验是否异常，详见表 1 和表 2。DNA 基因突变检测组成成分包括 LET 反应条 B(LET B)、LET 混合酶 B 和 LET 阳性对照 B。LET 反应条 B(LET B)和 LET混合酶 B 用于样本 DNA 扩增检测。PCR 反应液已预先分装于PCR 8 联管(LET B)中，8 联管内装有各自相应的 PCR 反应液，DNA 基因突变检测由①~③号管 FAM 和 ROX 信号指示，①~③号管 VIC 信号用于指示 DNA 样本质控实验是否异常，DNA样本质量由⑧号管 FAM 和 ROX 信号指示，详见表 1 和表 3。试剂盒采用 8 联 PCR 管设计，管内装有相应的检测试剂。每一例样本检测需要 1 条 LET 反应条 A(LET A)和 1 条 LET 反应条 B(LET B)，其中 LET 反应条 A 在 8 联 PCR 管上标识字母“A”，LET 反应条 B 在 8 联 PCR 管上标识字母“B”。8 联PCR 管若一端为平端，另一端为梯形端，则平端为 1 号管，梯形端为 8 号管；若 PCR 管两端各有一个小孔，则小孔居侧端为1 号管，小孔居中端为 8 号管。表 1 试剂盒组成
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表 2 LET 反应条 A 组成
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表 3 LET 反应条 B 组成
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本试剂盒用于体外定性检测非小细胞肺癌（NSCLC）患者福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本 DNA/RNA 中人类 EGFR、ALK、ROS1 和 MET 基因 14 号外显子跳跃突变，具体突变位点信息详细产品说明书。其中 EGFR 基因 19 号外显子缺失突变和 L858R 突变可用于盐酸厄洛替尼片和甲磺酸奥希替尼片的伴随诊断；EGFR 基因 T790M 突变可用于甲磺酸奥希替尼片的伴随诊断；ALK 基因融合和 ROS1 基因融合可用于克唑替尼胶囊的伴随诊断；MET 基因外显子 14 跳跃突变可用于谷美替尼片和盐酸特泊替尼片的伴随诊断。具体信息详见表 4。表 4 伴随诊断用途的基因变异类型及相应的靶向药物![]()
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该试剂盒以 NSCLC FFPE 样本 RNA 和 DNA 为检测对象。RNA 检测是通过两步 RT-qPCR 方法对样本 RNA 中基因融合进行检测，均由 FAM 信号指示；RNA 各检测管均含有扩增人类管家基因的检测试剂，用于监控样本 RNA 质量和加入情况，均由 VIC 信号指示。DNA 检测是通过 ADx-ARMS®技术对样本 DNA 中基因突变进行检测，由 FAM 和 ROX 信号分别指示不同突变位点。ADx-ARMS®技术是针对突变位点设计特异的突变检测引物，PCR 扩增时，由于该引物 3'末端的碱基与突变型模板完全配对，引物延伸并扩增出突变模板；而与野生型模板由于不能完全配对，引物的延伸被阻断，野生型模板扩增被抑制，从而实现基因突变的检测。试剂盒 PCR 扩增反应系统同时含有 UNG 酶，可以选择性断裂含有 dU 的 PCR 片段中的尿嘧啶糖苷键，有效降低因 PCR产物污染产生的假阳性。主要原材料包括引物、探针、DNA 聚合酶、逆转录酶、UNG酶和 dNTP，这些原材料均为外购方式获得。自行设计的引物、探针委托专业的合成公司合成，并经HPLC 纯化获得；DNA 聚合酶、逆转录酶、UNG 酶和 dNTPs 等均由有资质的原料供应商提供。通过功能性试验，申请人筛选出最佳原材料和供应商，同时制定了各主要原材料质量标准并检验合格。申请人设计了完整的企业参考品，包括阳性参考品、阴性参考品、最低检测限参考品和精密度参考品，除了 2 支阴性参考品为大肠杆菌来源的核酸外，其他参考品均采用临床样本制备而成。阳性参考品共 138 支，包括试剂盒可检出所有融合类型不同融合含量和所有突变类型不同突变比例的 132 支阳性参考品及 6 支双阳性参考品。阴性参考品共 20 支，9 支为临床 FFPE阴性 RNA，9 支为临床 FFPE 阴性 DNA，另外 2 支分别为非人基因组样本（大肠杆菌）的 RNA 和 DNA。检测限参考品共 44支，包括试剂盒可检出的所有融合/突变类型。精密度参考品共27 支，包括阴性精密度参考品、不同突变比例的阳性精密度参考品。产品同时设置了阳性对照和阴性对照，用于检测过程中试剂盒和仪器的质量控制。申请人对该产品反应体系的研究包括 PCR 反应体积、逆转录体积、反应液各组分和酶液等使用量研究、核酸和 cDNA 用量研究、PCR 扩增反应条件研究、循环数研究等。通过功能性实验，确定了最佳的反应体系。申请人根据试剂盒中试剂和组件的主要生产工艺的研究结果，确定了最佳的生产工艺。分析性能评估内容包括准确度、精密度、最低检测限、分析特异性、核酸提取性能等研究。申请人提交了三批产品在适用机型上的性能评估资料。准确度研究中，使用 3 批成品试剂盒在适用机型上对企业参考品、国家标准品进行检测，检测结果显示阳性参考品符合率、阴性参考品符合率均为 100%。精密度研究中使用 3 批成品试剂盒在适用机型上对阴性参考品和阳性精密度参考品进行检测，评价本产品批内、批间、日内、日间、人员间、不同 PCR 仪器、不同地点和再现性精密度，结果显示检测结果符合率均为 100%，检测变异系数均不大于5%。最低检测限研究中，申请人使用不同核酸浓度和不同融合含量及不同突变比例的样本进行检测，采用 95%（n=20）的阳性检出率作为标准，初步确定产品最低检测限。然后使用 3 批成品试剂盒在适用机型上对检测限参考品进行了验证。分析特异性研究包含交叉反应研究和干扰研究，交叉反应研究包括序列相近和具有一定同源性的其他常见突变类型、NSCLC 其他常见基因突变类型和非人类基因组基因。申请人使用 3 批试剂盒对交叉反应样本进行检测，结果显示均无交叉反应。干扰试验结果显示，临床样本中可能存在的外源干扰物质（乙醇、二甲苯、蛋白酶 K、液体石蜡、大肠杆菌、酵母菌、福尔马林）、内源性干扰物质（血红蛋白、甘油三酯）和药物（紫杉醇、培美曲塞、吉西他滨、吉非替尼、埃罗替尼、退热净、阿莫西林、头孢克罗、布洛芬等）对检测结果均无影响。申请人采用临床样本对核酸提取试剂盒进行了性能研究，根据与该产品的组合性能研究结果，确定核酸提取试剂符合检测需求。阳性判断值的建立研究选取了 410 例 NSCLC FFPE 样本（用于基因融合检测）和 640 例 NSCLC FFPE 样本（用于基因突变检测），分别统计融合反应管 FAM 和突变反应管 FAM/ROX通道 Ct 值，并计算突变管 FAM/ROX 通道ΔCt 值，通过受试者工作特征（ROC）曲线确定本产品的阳性判断值，再用临床样本对阳性判断值进行验证。表 5 LET 反应条 A(LET A)FAM 信号结果判定
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表 6 LET 反应条 B(LET B)FAM/ROX 信号结果判定
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样本 RNA 基因融合阴阳性的判定是根据样本 LET 反应条A(LET A)①号管和⑤~⑦号管 FAM 信号 Ct 值进行，详见表 5；样本 DNA 基因突变阴阳性的判定是根据样本 LET 反应条B(LET B)①~③号管 FAM 和 ROX 信号的 Ct 值进行，具体判定详见表 6。申请人对产品实时稳定性、运输稳定性、开瓶冻融稳定性和样本稳定性进行了系统的研究，确定了在各种条件下本产品及样本的有效保存时间。实时稳定性研究：将3批试剂盒储存于规定储存条件下，分别在0、8和10个月对物理性能、准确度、特异性、检测限和精密度进行考察，各项性能指标均符合要求，确定产品在20±5℃条件下，可稳定保存8个月。此外，申请人对产品的开瓶冻融稳定性、运输稳定性和样本稳定性分别进行了研究。结果显示，产品性能均能满足产品说明书声称。申请人在北京肿瘤医院、山西省肿瘤医院、福建医科大学附属协和医院和哈尔滨医科大学附属肿瘤医院共4家临床机构完成了临床检测性能的试验，同时通过桥接试验的方式在药物临床试验期间完成了伴随诊断意义的研究。第一部分：采用试验体外诊断试剂与临床参考方法（二代测序）等进行对比试验，评价试验体外诊断试剂的临床检测性能。针对该部分研究，入组病例以非小细胞肺癌患者为主（包括腺癌、鳞癌、腺鳞癌和大细胞癌），样本类型为FFPE样本。临床试验纳入统计受试者共862例。其中，EGFR基因共检出阳性例数457例；ALK基因融合阳性106例；ROS1基因融合阳性87例；MET跳跃突变阳性91例。试 验 结 果 显 示 ：EGFR 基 因 检 测 结 果 ， 阳 性 符 合 率99.6%(95%CI：98.4%～99.9%)，阴性符合率100%(95%CI：99.1%～100.0%)，总符合率为99.8% (95%CI：99.2%～99.9%)。ALK基因检测结果，阳性符合率98.1%(95%CI：93.3%～99.5%)，阴性符合率99.6%(95%CI：98.8%～99.9%)，总符合率为99.4% (95%CI：98.7%～99.8%)；ROS1基因检测结果，阳性符合率100%(95%CI：95.6%～100%)，阴性符合率99.6%(95%CI：98.9%～99.9%)，总符合率为99.7% (95%CI：98.9%～99.9%)；MET基因检测结果，阳性符合率96.8%(95%CI：91.0%～98.9%)，阴性符合率100%(95%CI：99.5%～100%)，总符合率为99.7%(95%CI：98.9%～99.9%)。第二部分：采用试验体外诊断试剂与原研伴随诊断试剂进行比较研究，评价试验体外诊断试剂的伴随诊断性能。针对该部分研究，采用本产品与原研伴随诊断试剂进行一致性研究。入组病例均为非小细胞肺癌患者，主要是药物临床试验适应症人群，样本类型为FFPE样本。其中，EGFR 基因共纳入有效样本341 例；ALK 融合基因检测纳入有效样本 328例；ROS1 融合基因检测纳入统计分析的有效样本 312 例。试 验 结 果 显 示 ：EGFR 基 因 检 测 结 果 ， 阳 性 符 合 率100%(95%CI：98.1%～100.00%)，阴性符合率99.3%(95%CI：96.3%～99.9%)，总符合率为99.7% (95%CI：98.4%～100%) 。ALK基因检测结果，阳性符合率100%(95%CI：96.2%～100%)，阴性符合率99.1%(95%CI：96.9%～99.8%)，总符合率为99.4%(95%CI：97.8%～99.8%)；ROS1基因检测结果，阳性符合率100%(95%CI ：95.6% ～ 100%)，阴性符合率 100%(95%CI ：98.3%～100%)，总符合率为100% (95%CI：98.8%～100%)。第三部分：采用桥接研究，评价试验体外诊断试剂对于特泊替尼药物的伴随诊断性能。针对该部分研究，采用本产品与CTA进行一致性研究，共入组药物临床试验中病例的416例样本，样本类型为FFPE样本。试验结果显示：试验用体外诊断试剂与CTA的阳性符合率为99.3%(95%CI：96.0%～100.00%)，阴性符合率98.2%(95%CI：95.8%～99.4%)，总符合率为98.6% (95%CI：96.9%～99.5%)。 另外，针对药物临床试验纳入的208例MET跳跃突变阳性的FFPE组织样本，本次桥接试验纳入132例，试验体外诊断试剂检测阳性的为131例。对于药物临床试验中的主要评价指标，上述131个样本来源病例的客观缓解率（ORR）为53.4%（95%CI：44.5%，62.2%），与药物临床试验结果基本一致；对于药物临床试验中的其他次要评价指标也进行了充分评价，结果显示，上述131个病例的次要评价指标的结果也与药物临床试验中结果基本一致；同时，针对需要进行敏感性和插补分析的情况也进行了分析。第四部分：采用桥接研究，评价试验体外诊断试剂对于谷美替尼药物的伴随诊断性能。针对该部分研究，采用本产品与CTA进行一致性研究，共入组药物临床试验中病例的217例样本，样本类型为FFPE样本。试验结果显示：试验用体外诊断试剂与CTA的阳性符合率为100%(95%CI：96.9%～100.00%)，阴性符合率100%(95%CI：96.1%～100%)，总符合率为100% (95%CI：98.3%～100%)。另外，针对药物临床试验纳入的79例MET跳跃突变阳性的FFPE组织样本，本次桥接试验纳入69例，试验体外诊断试剂检测阳性的为69例。对于药物临床试验中的主要评价指标，上述69个样本来源病例的客观缓解率（ORR）为65.2%（95%CI：52.8%，76.3%），与药物临床试验结果基本一致；对于药物临床试验中的其他次要评价指标也进行了充分评价，结果显示，上述69个病例的次要评价指标的结果也与药物临床试验中结果基本一致；同时，针对需要进行插补分析的情况也进行了分析。综上所述，该产品临床试验设计符合《体外诊断试剂临床试验技术指导原则》的相关要求。临床试验结果显示该产品临床性能满足临床要求。根据YY/T 0316-2016《医疗器械－风险管理对医疗器械的应用》对产品进行风险分析。本试剂盒用于体外定性检测非小细胞肺癌（NSCLC）患者福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本 DNA/RNA 中人类 EGFR、ALK、ROS1 和 MET 基因 14 号外显子跳跃突变，具体突变位点信息详细产品说明书。其中 EGFR 基因 19 号外显子缺失突变和 L858R 突变可用于盐酸厄洛替尼片和甲磺酸奥希替尼片的伴随诊断；EGFR 基因 T790M 突变可用于甲磺酸奥希替尼片的伴随诊断；ALK 基因融合和 ROS1 基因融合可用于克唑替尼胶囊的伴随诊断；MET 基因外显子 14 跳跃突变可用于谷美替尼片和盐酸特泊替尼片的伴随诊断。本产品临床应用的主要受益在于：可以作为盐酸厄洛替尼片、甲磺酸奥希替尼片、克唑替尼胶囊、谷美替尼片和盐酸特泊替尼片的伴随诊断试剂对靶向用药人群进行筛选，从而让NSCLC患者获得及时的治疗。申请人对已知危险（源）进行风险评价，按照风险可接受准则判断每个危险（源）的风险是否达到可接受水平，对合理可行降低的风险、不经过风险/收益分析既判定为不可接受的风险采取控制措施，并对具体措施进行实施验证，同时重新对采取措施后的风险进行估计，确认其风险水平是否可接受。但为保证用械安全，基于对主要剩余风险的规避，需要在说明书中提示以下信息：本试剂盒用于体外定性检测非小细胞肺癌（NSCLC）患者福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本 DNA/RNA 中人类 EGFR、ALK、ROS1 和 MET 基因 14 号外显子跳跃突变，具体突变位点信息详细产品说明书。其中 EGFR 基因 19 号外显子缺失突变和 L858R 突变可用于盐酸厄洛替尼片和甲磺酸奥希替尼片的伴随诊断；EGFR 基因 T790M 突变可用于甲磺酸奥希替尼片的伴随诊断；ALK 基因融合和 ROS1 基因融合可用于克唑替尼胶囊的伴随诊断；MET 基因外显子 14 跳跃突变可用于谷美替尼片和盐酸特泊替尼片的伴随诊断。本试剂盒检测结果仅供临床参考，不应作为患者个体化治疗的唯一依据，临床医生应结合患者病情、药物适应症、治疗反应及其它实验室检测指标等因素对检测结果进行综合判断。2.警示及注意事项：产品说明中介绍了该产品检验方法的局限性及使用中的注意事项。综合评价意见
本申报项目为境内第三类体外诊断试剂产品注册。依据《医疗器械监督管理条例》（国务院令第739 号）、《体外诊断试剂注册与备案管理办法》（国家市场监督管理总局令第 48 号）等相关医疗器械法规与配套规章，经对申请人提交的注册申报资料进行系统评价, 申报产品符合安全性、有效性的要求，符合现有认知水平，建议准予注册。2024 年 9 月 3 日
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