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今天这篇文献是南京医科大学王科明团队今年8月发表在该刊。本文以铁死亡和m6A为研究内容，相信大家对于这两个方向一定不陌生吧，一个是中标数400+的大热门，一个是中标数升到200+的新晋黑马，那么两个热点结合又会碰撞出怎样的火花呢？跟着小薇师姐看看吧！
1.文章首次揭示了长非编码RNA ABHD11-AS1通过m6A修饰在结直肠癌中表达上调，这一发现为理解m6A修饰在肿瘤发生中的作用提供了新视角。
2.研究阐明了ABHD11-AS1与FOXM1之间的正反馈调控机制，其中ABHD11-AS1与IGF2BP2相互作用可以增强FOXM1 mRNA的稳定性，而FOXM1又能够促进ABHD11-AS1的转录，形成了一个调控肿瘤进展的正反馈回路。
3.文章揭示了E3泛素连接酶TRIM21在调控IGF2BP2蛋白稳定性中的新功能，ABHD11-AS1可以促进TRIM21与IGF2BP2之间的相互作用，导致IGF2BP2的泛素化和降解，这一机制对于结直肠癌细胞的增殖和铁死亡具有重要影响。
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题目：lncRNA ABHD11-AS1 的 m6A 修饰通过 TRIM21/IGF2BP2/FOXM1 正反馈环促进结直肠癌进展并抑制铁死亡
期刊：Cancer Letters
影响因子：9.1
发表日期：2024年8月
公众号回复“123”领取原文PDF，文献编号：20241026
研究背景
结直肠癌（CRC）是一种常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率都很高。尽管目前关于CRC的治疗方法不断进步，但其发病机制尚未完全阐明，这给临床预防和治疗带来了挑战。因此，探索新的生物标志物对于改善结直肠癌患者的预后至关重要。长非编码RNA（lncRNA）在癌症的转移、复发和预后不良中扮演着重要角色，并且参与了大量的转录调控过程。但lncRNA在结直肠癌中的异常表达尚不清楚。
研究思路
本研究通过分析CRC患者的样本和细胞系，利用GEPIA和BEST网站分析了长非编码RNA ABHD11-AS1在CRC中的表达水平，并通过RT-qPCR、细胞增殖、凋亡、迁移实验和小鼠模型探究了其在肿瘤中的作用。通过RNA稳定性实验、免疫共沉淀和RNA测序等方法，揭示了ABHD11-AS1与IGF2BP2的相互作用及其对FOXM1稳定性的影响，并通过MeRIP实验和统计分析研究了m6A修饰在ABHD11-AS1表达调控中的作用。最后，通过免疫组化染色评估临床样本中METTL3、IGF2BP2和FOXM1的表达水平，并分别探究了它们与ABHD11-AS1表达水平的相关性。
主要结果
1.ABHD11-AS1在人类结直肠癌组织中表达上调，并与恶性肿瘤相关
研究者利用GEPIA分析ABHD11-AS1（ABHD11反义RNA1）的表达，分析发现与正常组织相比，CRC组织中ABHD11-AS1的表达显著增加（图1A）。同时，研究者根据 BEST 网站的分析发现lncRNA ABHD11-AS1在GSE41258数据集中升高（图1B）。为了验证上述结果，研究者通过RT-qPCR检测了52,260对临床样本中ABHD11-AS1的表达水平，研究结果显示，与其它的262个癌旁组织相比，261个ABHD11-AS1在结直肠癌组织中发生了高表达（图1C）。此外，研究者通过ABHD11-AS1表达与临床病理特征之间的相关性分析发现ABHD11-AS1在 32个配对的临床样本中升高（图1G）。此外，研究还发现ABHD11-AS1水平的升高与肿瘤大小266（>4cm）（图1D）、晚期TNM分期（Ⅲ/Ⅳ）（图1E）和远处转移显著相关，而与与年龄和性别无关(图1F）。
通过评估ABHD11-AS1表达与KRAS突变的关系，研究发现有273例lncRNA ABHD11-AS1在KRAS 274突变的CRC患者中显著过表达，约占全球结直肠癌病例的40%（图1H）。基于GSE14333数据集和纳入研究患者信息的数据进行Kaplan-Meier分析，分析结果表明有277例ABHD11-AS1表达升高，CRC患者总生存期较短（图1I-J）。此外，核质分离测定和 FISH 分析结果表明 lncRNA ABHD11-AS1主要位于细胞质中（图1K-L）。
图1 lncRNA ABHD11-AS1在CRC中作为致癌lncRNA的鉴定
2.ABHD11-AS1在体外促进CRC细胞的增殖和迁移
研究通过CCK8和集落形成实验发现ABHD11-AS1（si-ABHD11-AS1）沉默能够抑制HCT116和Lovo细胞的增殖，而ABHD11-AS1（pcDNA-ABHD11-AS1）过表达则能促进细胞增殖（图2A-B）。同时，EdU掺入实验分析也表明ABHD11-AS1沉默能够减少CRC细胞的增殖，而ABHD11-AS1过表达则有相反的效果（图2C）。研究者通过流式细胞术发现ABHD11-AS1沉默能够增加CRC细胞的凋亡比例，并抑制细胞周期的G0/G1阶段，减少S和G2/M阶段的细胞比例（图2D-E）。此外Transwell实验结果也表明ABHD11-AS1沉默能够抑制CRC细胞的迁移能力，而ABHD11-AS1过表达则能增强细胞的迁移能力（图2F）。
图2 ABHD11-AS1在体外促进CRC细胞的增殖和迁移
3.ABHD11-AS1 在体外调节 CRC 铁死亡并在体内促进 CRC 细胞生长
研究者对ABHD11-AS1调控CRC细胞铁死亡和促进肿瘤生长中的作用进行了深入探究，结果发现特异性抑制剂处理ABHD11-AS1敲低的CRC细胞，可以逆转细胞活力的降低，其中铁死亡抑制剂Fer-1和凋亡抑制剂Z-VAD-FMK能够显著恢复细胞活力，表明ABHD11-AS1与铁死亡之间存在潜在关联（图3A）。铁死亡相关指标的检测表明ABHD11-AS1沉默可以显著提高Fe2+和丙二醛(MDA)水平，降低谷胱甘肽(GSH)水平（图3B-D）。此外，研究者通过DCFH-DA探针检测发现活性氧(ROS)水平显著增加（图3E-F）。
为了进一步探究ABHD11-AS1在体内对结直肠癌的作用，研究者建立了BALB/c裸鼠移植瘤模型，并分别用空载体和sh-ABHD11-AS1转染人结肠癌HCT116细胞（图3G），肿瘤体积和肿瘤重量的测量结果显示ABHD 11-AS 1敲低组的两个参数均显著降低（图3H-I）。此外，在ABHD 11-AS 1敲低组中还观察到ABHD 11-AS 1和Ki 67发生了低表达（图3J-L）。
图3 ABHD 11-AS 1在体外调节CRC铁凋亡并在体内促进CRC细胞生长
4.ABHD 11-AS 1与IGF 2BP 2相互作用并通过FOXM 1影响CRC的发展
研究者通过RNA测序探究ABHD 11-AS 1调节CRC发展的潜在机制，差异基因表达分析显示ABHD 11-AS 1沉默会降低FOXM 1表达量，使其成为潜在的靶基因（图4B-C）。
为了进一步阐明lncRNA ABHD 11-AS 1调控结直肠癌的作用机制，研究者利用体外转录的生物素标记的ABHD 11-AS 1进行RNA下拉分析，并用银染色法检测洗脱液（图4D），质谱分析结果表明IGF 2BP 2在ABHD 11-AS 1下拉蛋白中出现富集现象（图4E），同时RNA下拉实验和RIP实验也进一步证明了IGF 2BP 2和ABHD 11-AS 1之间的相互作用（图4F），并确定了ABHD 11-AS 1中141- 353 nt片段是与IGF 2BP 2相互作用的关键区域（图4G），而KH 3 -4的缺失显著影响了IGF 2BP 2和ABHD 11-AS 1的相互作用（图4H）。
此外，研究者发现当ABHD 11-AS 1被沉默后，IGF 2BP 2蛋白表达水平增加，而ABHD 11-AS 1过表达则出现相反的结果（图4I）。共聚焦图像显示了CRC细胞的细胞质中ABHD 11-AS 1（红色）和IGF 2BP 2（绿色）的共定位（图4J），进一步揭示了二者之间的相互作用。
本研究通过RIP测定发现当ABHD 11-AS 1被沉默时，IGF 2BP 2和FOXM 1之间的相互作用被抑制，表明ABHD 11-AS 1通过与IGF 2BP 2相互作用来调节FOXM 1（图4K）。此外，研究发现IGF 2BP 2敲除降低了ABHD 11-AS 1过表达对FOXM 1稳定性的增强作用（图4L）。
图4 ABHD 11-AS 1与IGF 2BP 2相互作用并通过FOXM 1影响CRC的发展
5.ABHD 11-AS 1通过E3连接酶TRIM 21促进IGF 2BP 2泛素化和降解
为了研究ABHD 11-AS 1是否通过促进IGF 2BP 2蛋白的降解来降低其表达，研究者通过蛋白合成抑制剂放线菌酮（CHX）处理CRC细胞，并测定ABHD 11-AS 1沉默或过表达后IGF 2BP 2的半衰期。研究结果表明，ABHD 11-AS 1沉默增加IGF 2BP 2的半衰期，而ABHD 11-AS 1的异位表达降低其半衰期（图5A）。此外，研究发现蛋白酶体抑制剂MG 132可阻断ABHD 11-AS 1诱导IGF 2BP 2蛋白表达下调（图5B）。泛素化分析结果也表明，ABHD 11-AS 1沉默降低IGF 2BP 2的泛素化，而ABHD 11-AS 1的过表达会显著促进其泛素化（图5C-D）。这些结果表明，ABHD 11-AS 1可促进蛋白酶介导的IGF 2BP 2在CRC细胞中的泛素化和降解。
为了探索可能与IGF 2BP 2的泛素介导的蛋白酶降解相关的潜在泛素酶或去泛素酶，研究者进行了co-IP和质谱（MS）分析（图5E）。银染色结果（图5F）在MS分析中仅揭示了一种E3连接酶TRIM 21（图5G），表明TRIM 21可以直接与IGF 2BP 2结合。co-IP和蛋白质印迹结果也进一步证明了IGF 2BP 2和TRIM 21之间能够特异性结合（图5H）。同时，RNA下拉和RIP实验也证明了TRIM 21和ABHD 11-AS 1之间的相互作用（图5I）。
图5 ABHD 11-AS 1通过E3连接酶TRIM 21促进IGF 2BP 2泛素化和降解
6.TRIM 21促进IGF 2BP 2泛素化，ABHD 11-AS 1促进IGF 2BP 2和TRIM 21之间的相互作用
研究者在探究TRIM21对IGF2BP2调节机制时发现，当TRIM21被沉默时，IGF2BP2增加，而TRIM21过表达则具有相反的效果；TRIM21诱导IGF2BP2的下调被MG132处理得到调节（图5J），表明CRC细胞中IGF2BP2的蛋白酶体依赖性降解可能归因于TRIM21（图5A和图5B）。此外，在CHX处理的CRC细胞中，TRIM21沉默会增加IGF2BP 2的半衰期，而TRIM21过表达降低IGF2BP 2的半衰期（图5K）。此外，研究发现TRIM 21的敲低会导致IGF2BP 2的泛素化水平显著降低（图6A），并且野生型TRIM 21能够降低由TRIM 21敲低诱导的IGF2BP 2的蛋白水平，同时恢复IGF2BP 2的泛素化水平（图6B-C）。
研究者为确定IGF 2BP 2上哪些类型的多聚泛素修饰受TRIM 21调控，构建了一系列泛素突变体，研究发现TRIM 21敲低抑制IGF 2BP 2的Lys 48（K48）-连接的泛素化，但对Lys 63（K63）-连接的泛素化没有影响（图6D）。通过共聚焦显微镜检测TRIM21和IGF2BP2的亚细胞共定位，结果显示TRIM21和IGF2BP2共定位于CRC细胞的胞浆中（图6E）。蛋白质结构域分析和免疫沉淀分析表明，TRIM 21的RING区域（氨基酸16-55）与IGF 2BP 2的KH 1 -2区域（氨基酸195-352）相比介导了更强的与KH 3 -4区域（氨基酸426-586）的相互作用（图6F-H）。研究者对ABHD 11-AS 1是否可以影响TRIM 21和IGF 2BP 2之间的相互作用进行了评估，结果表明ABHD 11-AS 1沉默会降低TRIM 21和IGF 2BP 2之间的相互作用（图6I）。另外，ABHD 11-AS 1过表达恢复了由TRIM 21沉默诱导的IGF 2BP 2 454的泛素化水平（图6J）。
图6 TRIM21促进IGF 2BP 2泛素化，ABHD 11-AS 1促进IGF 2BP 2和TRIM 21之间的相互作用
7.ABHD 11-AS 1通过m6A修饰上调，并通过与FOXM 1的正反馈回路促进CRC的发展
研究者通过对METTL3和METTL14敲除后ABHD 11-AS 1的表达进行测定，并以此判断它们在调节ABHD 11-AS 1的m6A修饰中的作用。RT-qPCR结果显示，METTL3和ABHD 11-AS 1的表达呈正相关，而METTL14对ABHD 11-AS 1水平无影响（图6K）。同时，RIP分析揭示了METTL3敲低降低了476 ABHD 11-AS 1与IGF 2BP 2的富集，表明ABHD 11-AS 1 477和IGF 2BP 2之间的结合受METTL3诱导的m6A修饰的调节（图6L）。此外，研究者对6个评分较高的突变体进行了荧光素酶报告试验，Mut5和Mut7的荧光素酶活性与WT组相比降低，METTL3沉默对Mut5和Mut7的荧光素酶活性没有显著影响，表明位点5和位点7是最重要的结合位点（图6N）。
研究发现当FOXM 1被沉默时，ABHD 11-AS 1表达降低，表明FOXM 1对ABHD 11-AS 1表达的有潜在调节作用（图7A）。通过对ABHD 11-AS 1 492启动子区结合位点的预测，研究者构建了覆盖潜在结合位点的3个荧光素酶报告质粒，以进行ChIP和双荧光素酶报告分析（图7B）。综合分析结果表明-590和-582之间的位点是ABHD 11-AS 1启动子区中FOXM 1的潜在结合位点（图7C-D）。
图7 m6A/ABHD11-AS1/TRIM21/IGF2BP2/FOXM1正反馈回路的临床关系
8.m6A/ABHD 11-AS 1/TRIM 21/IGF 2BP 2/FOXM 1正反馈环在结直肠癌中的临床意义
通过对52例结直肠癌标本的METTL3、IGF 2BP 2、FOXM 1进行免疫组化染色，染色结果显示，在ABHD 11-AS 1高表达的情况下，METTL3和FOXM 1上调，而IGF 2BP 2下调（图7 E）。此外，RT-qPCR分析揭示了ABHD 11-AS 1、METTL3和FOXM 1之间的正相关性，以及ABHD 11-AS 1、IGF 2BP 2和TRIM 21之间的负相关性（图7F-G）。这些结果证明lncRNA ABHD 11-AS 1的m6 A修饰通过TRIM 21/IGF 2BP 2/F0 XM 1正反馈环促进结肠直肠癌进展和抑制铁凋亡（图7H）。
文章小结
这篇文章通过综合应用生物信息学分析、分子生物学技术和体内外实验方法，揭示了长非编码RNA ABHD11-AS1在结直肠癌中的促癌作用及其分子机制，为结直肠癌的诊断和治疗提供了潜在的新靶点。不得不说，这真是一篇内容丰满的文章啊！虽然实验内容比较多，但在技术层面还是很容易操作的，加上国自然的热点的加持，想要发文更是事半功倍，对此感兴趣的朋友都可以来找小薇师姐聊一聊！这里可以提供方案设计、个性化数据分析以及项目评估等服务，欢迎大家前来滴滴！
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