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小伙伴们可能听说了，都2024年了怎么还有人在玩lncRNA？！这个过气的RNA分子成为了继miRNA后人人喊打的“过街老鼠”。各种撤稿造假，以及lncRNA与miRNA互作的讨论文层出不穷。当然与时髦的单细胞测序以及空间组学比起来，lncRNA的热度确实是有所下降。但是lncRNA有大家说的那么不堪吗？我们先来看几组数据。首先是Pubmed上以lncRNA以及long non-coding RNA为关键词搜索lncRNA已发表的文献，我们发现从2018年到2024年，lncRNA整体发文数量还在不断上升，而2023年全年更是超过了60,000篇，通讯作者单位不乏像是哈佛大学医学院、MIT、斯坦福大学、英国桑格研究所、德国马普研究所等顶级学术机构。那么说完了数量再说质量，到2024年lncRNA是不是真的过气了呢？是不是只能在水刊灌水呢？我们可以看到即便是像Nature Cancer、Circulation Research、Science Translational Medicine等期刊，依旧有不少lncRNA的优秀研究发表。 我们进一步统计这些发表在2024年且影响因子在10分以上的杂志，发现以上关键词出现频率极高，而七八年前经典的competing binding与miRNA进行ceRNA互作的文章，目前数量反而不是特别多。其中这些高分文章里，又以翻译多肽、组蛋白修饰/转录因子/启动子等频率占据大部分。另外小部分为m6A修饰、外泌体等领域。那么讲完发文情况，我们再来看看国自然情况又如何呢？从2018年到2023年，lncRNA及circRNA相关资助项目总数量每年一直稳定在350项左右，但是资助金额在2021年后反而出现了抬头，资助总金额每年达到了2亿元以上。那么究竟是是哪些lncRNA项目获得了基金委专家的青睐呢？很显然，诸如组蛋白修饰、DNA结构、蛋白RNA骨架、RNA修饰、启动子调控等方向正在重新回到人们的视野，反而是lncRNA-miRNA互作，近些年除了一些特殊的非模式生物外几乎很难看到资助的身影。 所以接下来我们就来看看，除了被人人吐槽的lncRNA-miRNA互作机制，lncRNA究竟要怎么玩？我们以2019年发表在Nature Reviews上名为“Long non-coding RNAs in genitourinary malignancies: a whole new world”以及2022年Molecular Cell上名为“Integrated lncRNA function upon genomic and epigenomic regulation”这2篇经典综述为例，阐述了lncRNA几种常见的调控方式和作用机制。当然lncRNA在细胞核与细胞质中调控机制也不尽相同。在细胞核中，lncRNA涉及到染色质开放与重拍、组蛋白修饰调控、启动子调控、RNA可变剪切、RNA出核转运等功能
在细胞质中，lncRNA主要涉及到RNA降解、线粒体功能、翻译小肽、RNA Turnover等，其中lncRNA翻译小肽一直是国自然和高分文章的热点。讲完了那么多，那么该如何设计自己的lncRNA课题呢？通常细胞我们推荐3个重复起，组织我们推荐4个重复起。先进行差异分析后，得到差异表达lncRNA。这边目前推荐有3条技术路线：编码小肽、lncRNA表观调控以及ceRNA机制，各自需要搭配密码子预测+翻译组测序、lncRNA pulldown以及ceRNA互作分析及后期双报告基因验证。需要注意的是，由于lncRNA在细胞核和细胞质定位不同，发挥的功能也不同，无论是测序还是后期验证，我们推荐细胞样本先进行细胞核与细胞质分离后，分开进行后续的测序和验证实验。 接下来，我们就来看看2023年到2024年期间发表的一些比较优秀的lncRNA案例，来看看Top课题组是怎么研究lncRNA的。 案例1：lncRNA翻译编码小肽引起抗肿瘤免疫反应
这是一篇来自牛津大学Thangue课题组发表的Nature Communications上的关于lncRNA的研究。这篇文章最大的亮点在于，首先锚定了lncRNA能够翻译小肽这个方向，然后非常丝滑与这些lncRNA衍生小肽具有免疫原性的特点，最终激活免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。作用运用了lncRNA测序、ChIP-seq、翻译组Polysome Profiling、质谱多肽组学等多种组学手段。相似的思路还有利用病毒激活免疫系统，从免疫沙漠变为免疫高浸润状态，以及利用TCR和BCR刺激激活免疫细胞对肿瘤组织的杀伤，以及利用外显子测序预测新抗原来增加免疫细胞的杀伤能力。作者首先利用药物处理后发现小鼠结直肠癌细胞生长受到抑制，然后对这些细胞进行lncRNA测序发现大量lncRNA普遍下调。反之若不用药物处理则lncRNA上调。然后作者通过使用质谱多肽蛋白组学和翻译组Polysome Profiling，发现lncRNA能够翻译编码MHC I类小肽lncRNA衍生编码的小肽抑制肿瘤生长，这些小肽具有免疫原性，激发自身免疫系统抵抗肿瘤。使用病毒载体lncRNA疫苗策略能延缓肿瘤生长。所以整体来看这篇研究亮点属于lncRNA编码小肽+免疫原性与免疫细胞激活+RNA疫苗的组合。
案例2：lncRNA调控组蛋白修饰影响肿瘤发生新机制
在这篇Nature Communications的文章中，来自同济大学的张赫课题组发现lncRNA具有反式调控（trans regulation）作用，跨染色质招募组蛋白修饰调控酶影响基因的启动子激活，继而影响下游RNA表达水平。在这篇文章中，作者也运用了lncRNA测序、Pulldown、ATAC-seq、ChIP-seq多种组学手段。首先利用ATAC-seq和ChIP-seq证实PHB2能够同时结合黑色素瘤细胞中lncRNA CANT2和CCBE1的启动子区域，分别增加H3K4me3水平和降低H3K27ac水平。敲除CANT2后lncRNA测序表明，CCBE1表达上调，而过表达CANT2则相反。PHB2与CCBE1启动子互作。CANT2可能直接参与PHB2对CCBE1调控。通过一系列生化等手段以及ChIP实验证实，PHB2招募MLL2上调H3K4me3水平激活基因表达，招募HDAC1降低H3K27Ac水平抑制基因表达。
本项研究的亮点总结：PHB2通过组蛋白甲基化激活lncRNA CANT2的启动子，lncRNA CANT2过表达后通过trans反式调控跨染色体调控CCBE1组蛋白乙酰化水平，降低CCBE1的RNA表达水平。本研究体现了lncRNA通过招募组蛋白修饰调控相关上游的酶，继而影响组蛋白修饰而对组蛋白靶基因进行调控（转录上下调）。ATAC-seq可用于发现具体的RNA转录本（包括mRNA和lncRNA）启动子区域染色质开放程度，为后续转录因子和组蛋白修饰研究打下基础。Pulldown则可以发现具体的lncRNA或启动子与哪些蛋白相结合。lncRNA测序则为发现具体mRNA和lncRNA上下调，与ATAC-seq以及pulldown的质谱鉴定数据联合后，可迅速缩小并锁定相关基因/蛋白，此处则可以优先从调控上游的组蛋白以及转录因子入手，而本文作者就选择了组蛋白修饰。后续搭配ChIP-seq或CUT&Tag效果更佳。
