乳酸化又有新发现！PNAS重磅发文：RNA m6A去甲基化酶的乳酸化促进对DNA病毒的先天免疫反应

乳酸化真是科研界的当红辣子鸡，高分文章频出！最近（10月16日），南京医科大学卢春，贾雪梅，陈国春和中国农业科学院李霄合作在PNAS发表了题为“Lactylation of RNA m6A demethylase ALKBH5 promotes innate immune response to DNA herpesviruses and mpox virus”的研究性论文。主要围绕探究RNA m6A去甲基化酶ALKBH5的乳酸化如何调控对DNA病毒（包括疱疹病毒和痘病毒）的先天免疫反应。实验设计思路清晰，通过多步骤的实验验证了ALKBH5乳酸化在调控对DNA病毒的先天免疫反应中的作用，并揭示了ESCO2和SIRT6在其中的关键角色。每当遇到涉及乳酸化的研究思路甄博是一定不会放过的，感兴趣的小伙伴跟甄博一起往下看吧~ps：甄博这里可以为您提供个性化方案设计和数据分析服务，总之，您想要的服务咱们这里都有！欢迎滴滴哦！

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题目：RNA m6A去甲基化酶ALKBH5的乳酸化促进对DNA疱疹病毒和痘病毒的先天免疫反应

杂志：PNAS（IF：9.4）

发表时间：2024.10    

研究背景

RNA N6-甲基腺苷（m6A）去甲基化酶AlkB同源物5 （ALKBH5）在调节先天免疫中起重要作用。赖氨酸酰化是一种广泛存在的蛋白质修饰，影响蛋白质功能，但其在病毒感染过程中对ALKBH5的影响尚未得到很好的表征。本研究探讨了ALKBH5中赖氨酸酰化的存在和调控机制，以及它在介导m6A修饰激活抗病毒先天免疫反应中的作用。

研究思路

研究结果

ALKBH5赖氨酸K284的乳酸化促进对DNA病毒的先天性免疫反应

为了确定ALKBH5蛋白中发生的赖氨酸酰化修饰的类型，分别将ALKBH5-HA转导到HEK293T和THP1细胞中，然后进行免疫沉淀（IP）试验，分析已知的8种赖氨酸酰化，包括乳酸化（Kla）、琥珀酰化（ksuc）、丁基化（Kbu）、巴丁酰化（Kcr）、β-羟基丁基化（Kbhb）、丙酰化（Kpr）、丙二醛化（Kmal）和2-羟基异丁基化（Khib）。在HEK293T和THP-1细胞中，用抗kla抗体检测到了最突出的条带，表明ALKBH5可能经历了强烈的乳酸化。    

为了确认ALKBH5蛋白的乳酸化，将过表达ALKBH5-HA的细胞与乳酸孵育24小时。乳酸处理以浓度依赖的方式增加ALKBH5的乳酸化。此外，内源性乳酸化ALKBH5被抗kla抗体拉低。ALKBH5的氨基酸 92至293是负责其m6A去甲基化酶活性的主要区域。为了确定ALKBH5蛋白的乳酸化位点，作者首先突变了2OG-Fe(II)_Oxy_2结构域的9个赖氨酸(K)位点，生成ALKBH5 MD突变体。发现该结构域的所有赖氨酸突变都降低了ALKBH5的乳酸化水平。

液相色谱-质谱联用进一步鉴定了在2OG-Fe(II)_Oxy_2结构域中的4个赖氨酸(K)乳酸化位点。接下来，构建了K102R、K116R、K274R或K284R的个体突变，并测试了对ALKBH5乳酸化的影响。结果表明，只有K284R突变显著降低了ALKBH5的乳酸化水平。重要的是，K284是物种中高度保守的残基。    

接下来的目标是解决ALKBH5乳酸化的潜在功能。鉴于乳酸是赖氨酸乳酸化的直接诱导剂，作者对病毒感染细胞的培养基中乳酸的浓度进行了量化。观察到，在HSV-1、KSHV和MPXV感染后，细胞比未感染的细胞产生更多的乳酸。同样，在HSV-1、KSHV和MPXV感染的细胞中，可以检测到乳酸化修饰ALKBH5蛋白的水平升高，而总ALKBH5蛋白的表达水平未检测到变化。

敲低ALKBH5可减少DNA病毒感染后IFN- β的产生。WT过表达ALKBH5可恢复IFN- β mRNA的表达水平；而过表达ALKBH5 K284R突变体则不能增加IFN- β mRNA水平。ELISA结果显示ALKBH5 K284R突变体过表达并不能恢复下降的IFN- β蛋白水平。斑块分析观察到过表达WT ALKBH5抑制HSV-1和MPXV的复制；而过表达ALKBH5 K284R突变体则不能发挥这样的抑制作用。综上所述，这些数据表明ALKBH5的乳酸化赖氨酸K284促进先天免疫反应并抑制DNA疱疹病毒和MPXV的复制。    

ALKBH5乳酸化通过m6A修饰IFN-β mRNA增强IFN-β mRNA的生物生成

为了探究ALKBH5乳酸化如何促进IFN-β的产生，用环己亚胺（CHX）处理细胞，并测量了ALKBH5蛋白的稳定性。Western blotting显示ALKBH5乙酰化不影响其稳定性。免疫荧光 染色显示ALKBH5乙酰化不改变其亚细胞定位。m6A定量分析显示，ALKBH5过表达细胞中m6A水平降低；然而，在表达WT和K284R突变体ALKBH5的细胞中，m6A水平没有差异。接下来，作者分析了ALKBH5的乳酸化是否调节其m6A去甲基化酶活性，发现K284突变未能影响ALKBH5的总体m6A去甲基化酶活性。

为了研究ALKBH5乳酸化调控下特定的基因，作者进行了RNA免疫沉淀（RIP）实验。结果显示，在HSV-1感染的背景下，IFN- β的富集较少与WT ALKBH5相比，K284R突变体ALKBH5 mRNA的表达量显著增加，而其他转录本的表达量无显著差异检查。同样，在KSHV感染期间ALKBH5 K284R突变体表现出较低水平的IFN- β富集与WT ALKBH5相比。此外，检测到IFN- β mRNA m6A修饰水平升高病毒感染后，表达ALKBH5 K284R突变体的细胞比表达WT ALKBH5的细胞要多。接下来作者使用新生RNA 合成方法分析了 ALKBH5的乳酸化对IFN- β mRNA生物发生的影响。发现，在HSV-1和KSHV感染期间，表达ALKBH5 K284R突变体的细胞中，5-乙基尿嘧啶（EU）标记的IFN- β mRNA的水平低于WT ALKBH5。综上所述，这些数据表明ALKBH5乳酸化增加了ALKBH5与IFN- β mRNA的结合，降低了IFN- β mRNA m6A水平，促进了IFN-β mRNA的生物发生。    

ALKBH5在病毒感染过程中被ESCO2乳酸化

作者继续确定参与ALKBH5乳酸化的其他酰基转移酶。四种酰基转移酶，包括ESCO1、ESCO2、ATAT1和MYST1，与ALKBH5共表达，并进行IP分析以检测它们与ALKBH5的相互作用。结果显示，只有ESCO2能与ALKBH5结合。此外，检测了ALKBH5-ESCO2与内源蛋白的相互作用。为了测试ESCO2是否会使ALKBH5乳酸化，作者在细胞中共表达ALKBH5和ESCO2，观察到ALKBH5乳酸化的强烈增加。ESCO2过表达也导致内源性ALKBH5乳酸化增加。这些结果表明，ESCO2结合ALKBH5并诱导ALKBH5乳酸化。    

接下来，确定了ESCO2是否介导了病毒感染期间ALKBH5乳酸化的上调。一系列外源或内源蛋白相互作用分析表明，在DNA病毒感染的细胞中，ALKBH5免疫沉淀了更多的ESCO2。这些数据共同表明，病毒感染通过促进ESCO2与ALKBH5的相互作用来增加ALKBH5的乙酰化。

为了评估ESCO2在宿主防御病毒感染中的作用，作者用DNA病毒感染ESCO2过表达的细胞。发现，过表达ESCO2不仅增加了IFN-β的产生，而且还抑制了DNA病毒的复制。过表达ESCO2不影响细胞中总m6A水平；但是，它促进了IFN-β mRNA与ALKBH5的相互作用，降低了IFN- β mRNA m6A水平。并增加了IFN-β mRNA的生物发生。为了进一步研究ESCO2在ALKBH5乳酸化和先天免疫反应中的作用，使用CRISPR/Cas9方法敲低了ESCO2的表达。ESCO2表达的减少不仅降低了内源性ALKBH5的乳酸化，而且还减弱了IFN- β的产生，最终增强了病毒复制。    

SIRT6去乙酰化酶介导ALKBH5去乙酰化

为了确定可能调节ALKBH5乙酰化介导的抗病毒先天免疫反应的潜在去乙酰转移酶，作者检查了sirtuin家族蛋白（SIRT1至SIRT7）的七个成员。发现SIRT3、SIRT4、SIRT6和SIRT7与ALKBH5相互作用;然而，只有SIRT6才能使ALKBH5去乙酰化。内源性SIRT6和ALKBH5也相互作用（图6C）。此外，SIRT6过表达降低内源性ALKBH5蛋白的乳酸化水平。体外去乙酰化实验表明SIRT6确实去乙酰化了ALKBH5。这些结果表明SIRT6是一种与ALKBH5相互作用并使其去乙酰化的去乙酰化酶。    

接下来，确定病毒感染是否可能调节SIRT6诱导的ALKBH5去乙酰化。HSV-1感染没有改变SIRT6的表达水平，但降低了SIRT6与ALKBH5的相互作用。在KSHV感染期间SIRT6与 ALKBH5的结合减少。此外，还观察到在MPXV感染的细胞中SIRT6的表达较低，SIRT6与ALKBH5的相互作用减少。    

最后，作者确定了SIRT6在病毒感染期间先天免疫反应中的作用。SIRT6过表达抑制IFN-β的产生，导致病毒复制量增加。过表达SIRT6不影响细胞中总m6A水平。然而，它减少了ALKBH5与IFN- βmRNA的结合，增加了IFN- β mRNA的m6A水平，并减少了IFN- β mRNA的新生生物发生。另一方面，THP-1细胞中SIRT6的敲低促进了IFN-β的表达，随后减少了病毒复制。同时，SIRT6的选择性激活剂 UBCS039激活SIRT6，导致内源性ALKBH5乳酸化和IFN-β表达降低。

为了证实SIRT6在K284R处使ALKBH5去乙酰化，作者在细胞中共表达ALKBH5-K284R和SIRT6，并观察到ALKBH5的乙酰化水平没有明显变化，表明K284突变有效地消除了ALKBH5的SIRT6去乙酰化。此外，在DNA病毒感染期间，SIRT6过表达降低了表达ALKBH5- wt的细胞中IFN- β的诱导，而表达ALKBH5- k284r的细胞则没有。    

综上所述，这些结果表明SIRT6介导ALKBH5赖氨酸K284的去乙酰化，从而抑制宿主抗病毒先天免疫。

文章小结

该研究通过优化m6a介导的IFN-β mRNA生物发生，证明了ESCO2和SIRT6调控的ALKBH5的乳酸化促进了对DNA疱疹病毒和MPXV的先天免疫反应（图8）。这些结果为先天免疫反应的复杂机制提供了进一步的见解。

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